Сделай Сам Свою Работу на 5

C. Изучение ферментативной активности





Ферментативная активность Neis. gonorrеаеизучается в реакции окисления сахаров. Реакция может быть ложноположительной из-за контаминации исследуемых культур гонококков другими бактериями и ложноотрицательной при использовании гонококков, культивируемых более 24 часов (вследствие аутолиза микроорганизмов). Для предупреждения этих возможных факторов необходимо выделить чистую культуру гонококков путем пересева типичных колоний на чашки Петри с неселективной средой (шоколадный агар). Инкубация проводится в течение 18 - 24 часов.

Изучение ферментативной активности Neis. gonorrhoeaeможет проводиться в ростозависимых и ростонезависимых тестах. При проведении ростозависимых тестов сахара и другие субстраты (например, феноловый красный) вводятся непосредственно в питательную среду, на которой осуществляется рост гонококка. Однако в настоящее время эти тесты не могут быть рекомендованы, т.к. широко используемые ростонезависимые тесты дают возможность получить более быстрый (в течение нескольких часов) и специфический результат, позволяя идентифицировать исключительно Neis. gonorrhoeaeи исключить другие непатогенные нейссерий. Существуют коммерческие наборы для изучения ферментативной активности Neis. gonorrhoeae.



Оценка проводится по изменению цвета среды: при ферментации сахаров - от красного к желтому (результат положительный). Энзимсубстратные тесты с использованием ферментов (орто-нитрофенил-бета-галактозидаза (ONPG), гамма-глютамил аминопептидаза (GLU-AMP), гидроксипролил аминосинтидаза (PIP), гидроксипролин аминопептидаза (НРА), пролин аминопептидаза (Рго-АР)) предназначены для быстрой дифференциации между N. gonorrhoeae, N. meningitidis, N. tacarnicaи некоторыми штаммами N. cinerea и N. Catarrhalis. Результаты теста считаются положительными, если происходит изменение цвета среды - от бесцветного к желтому для ОФГ и от светло-желтого к интенсивно оранжевому для Глю-АП и Про-АЛ. Однако чувствительность и специфичиость этих быстрых энзимсубстратных тестов оказались неоптимальными.

Проведение видовой идентификации возможно также с использованием бактериологических анализаторов и коммерческих наборов реагентов.

D. Иммунологические/антигенные подтверждающие тесты



Иммунологические тесты рекомендуется использовать только в референс-лабораториях для окончательного подтверждения N. gonorrhoeae.

Иммунологические тесты с использованием моноклональных антител для прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), коагглютинации и иммуноферментного анализа являются высокочувствительными и специфичными для точной идентификации N. gonorrhoeae. Эти тесты могут проводиться с культурой нейссерий, выделенных при первичном посеве. При этом не требуется выделение чистой культуры гонококков, и изоляты могут быть идентифицированы на18 - 24 часа раньше, чем при изучении ферментативной активности N. gonorrhoea. Однако эти тесты дороже, чем ферментативные, коммерческие тест системы имеют меньший срок годности.

E. Прямая иммунофлюоресценция

Тест основан на использовании флюоресцирующих моноклональных антител против очищенного РroВ белка наружной мембраны гонококка, ранее называвшегося 1 или главный белок наружной мембраны гонококка. Очень важно строгое следование инструкции производителя каждого отдельного теста.

Молекулярно-биологические методы

Для выявления N. gonorrhoeaeмогут быть использованы ДНК/РНК методы, такие как полимеразно цепная реакция (ПЦР), а также методы, основанные на гибридизации. Однако результаты, полученные при использовании этих методов, должны оцениваться в связи с клинической ситуацией, т.к. после проведенного лечения гонореи в некоторых случаяхДНК может определяться в образцах до 2 - 3 недель после лечения.

Однако с целью получения живого микроорганизма и для определения чувствительности к антибиотикам проведение бактериологического исследования является необходимым у пациентов с клинической симптоматикой. В некоторых ситуациях молекулярно-биологические методы являются более чувствительными, чем культурадьный метод. Чувствительность культурального метода во многом определяется качеством питательной среды и условий транспортирования образца в лабораторию. При соблюдении условий транспортировки клинического материала в лабораторию, использовании качественных питательных сред, строгого проведения условий лабораторного исследования бактериаюгнческое исследование является методом выбора, и наоборот. Следовательно, выбор молекулярно-биологического или культурального метода зависит от организационных условий и качества проведения лабораторного исследования, а также от зпидемиологической ситуации в популяции. В популяции с повышенным риском распространения заболевания бактериологическое исследование является методом выбора. В популяции низкого риска, для скрининга и для исследования неинвазивных образцов, молекулярно-биологические методы подходят больше (к примеру, исследование мочи у мужчин и вагинальных образцов у женщин). Однако если метод используется для исследования популяции низкого риска и он не является высоко специфичным, возможно получение большого количества ложноположительных результатов. Молекулярно-биологические методы являются оптимальными для исследования образцов, полученных неинвазивным способом, но их чувствительность и специфичность вариабельны. Чувствительность молекулярно-биологических методов выше при исследовании образцов мочи у мужчин, по сравнению с женскими образцами. Оптимальным для женщин является исследование вагинальных материалов.



При исследовании пациентов без клинических симптомов заболевания молекулярно-биологические методы обязательно должны подтверждаться бактериологическим методом. Пока еще нет лицензированных молекулярно-биологических методов для исследования ректальных или фарингеальных образцов. ДНК/РНК-методы могут быть использованы для видового подтверждения N.gonorrhoeaeиз культур. Для этой цели материал, собранный петлей из специфической колонки, может быть перенесен в пробирку типа Эппендорф или любую другую пробирку со 100 мкл забуференного физиологического раствора. Однако этот тест не исключает необходимости предварительной идентификации N. gonorrhoeae.

Для проведения молекулярно-биологических методов из клинического образца необходимо выделить ДНК в соответствии с инструкцией изготовителя. Методы предназначаются для обнаружения N. gonorrhoeae в урогенитальных пробах. В большинстве случаев молекулярно-биологические методы имеют высокую чувствительность и специфичность. Однако наличие субстанций ингибиторов в некоторых образцах, а также тот факт, что у некоторых штаммов N. gonorrhoeae может не быть последовательности, являющейся мишенью для молекулярно-биологического метода, может приводить к снижению чувствительности метода. Известна недостаточная специфичность некоторых ДНК/РНК-методов, и получено большое количество ложноположительных результатов из-за перекрестных реакций с комменсальными видами нейссерий. таких как N. lactamlса, N. cinerea. N subjtava. Высокую специфичность показали новые методы ПЦР-анализа. использующие праймеры, направленные на РогА псевдоген N. gonorrhoeae.Этот ген (PorAJ/псевдо-ген подходит для дифференциальной диагностики N. gonorrhoeae и N. meningitides. Для всех экстрагенитальных образцов или для определения антибиотикочувствительности должно проводиться культивирование с последующей идентификацией нейссерий до вида.

A. Проведение анализа

Выделение ДНК и проведшие амплификации проводится строго в соответствии с инструкцией производителя диагностических наборов. Необходимо строгое соблюдение инструкций по уборке помещений и обработке поверхностей. После окончания работы рабочие поверхности должны обрабатываться ДНК/РНК деградирующими растворами для удаления ранее амплифицированных нуклеиновых кислот.

 








Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту:



©2015 - 2024 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.