Определение серотипа вируса ящура в РСК: принцип, задачи, компоненты, учёт результатов.

Идентификация выделенного вируса: определение, методы. РДП: принцип, задачи, компоненты, достоинства и недостатки.

Реакция диффузной преципитации (РДП) основана на том, что антитела и антигены по отдельности могут диффундировать в геле (в лабораторной практике чаще всего используют агар), а комплексы антиген-антитело – нет.

Антитела сыворотки – молекулы иммуноглобулинов. Способны диффундировать в агаровом геле несмотря на крупные размеры.

Антигены вирусов – вирусные белки. Они могут находиться в составе вирионов (корпускулярные антигены). В этом случае крупные размеры не позволяют им диффундировать в агаре. Растворимые антигены (свободные молекулы, образовавшиеся в результате деструкции вирионов или разрушения клетки) способны к диффузии в агаровом геле.

Антигены и антитела диффундируют навстречу друг другу, и при соответствии их друг другу образовавшийся комплекс антиген-антитело осаждается в виде линии преципитации. Если антиген и антитело не гомологичны, этого не происходит, и линия преципитации не образуется.

Методика.В слое агарового геля делают несколько лунок. В них наливают антигены и сыворотки, так, чтобы они находились в соседних лунках. Антигены и сыворотки диффундируют во все стороны от каждой лунки. При гомологичности компонентов между лунками образуется комплекс антиген-антитело и белая линия преципитации.

Задачи, решаемые с помощью РДП:

- Обнаружение в сыворотке крови (S) антител, гомологичных данному антигену (AS). Для этого вокруг лунки с антигеном располагают лунки с данной сывороткой и контрольными образцами.

- Обнаружение в материале антигена (A), гомологичного известным антителам сыворотки (SS). Для этого вокруг лунки с сывороткой располагают лунки с данным антигеном и контрольными образцами.

- Идентификация неизвестного вируса. Для решения этой задачи вокруг лунки с неизвестным антигеном (вирусом) располагают несколько лунок с сыворотками, содержащими различные антитела к предполагаемым вирусам. Образование линии преципитации говорит о соответствии между данным антигеном и антителами сыворотки, что позволяет сделать вывод о виде вируса.

- Титрование антител сыворотки. В этом случае в лунки вокруг лунки с антигеном заливают различные разведения сыворотки, содержащей антитела. Показателем титра антител в сыворотке является высшее разведение сыворотки, ещё дающее преципитацию.

РДП чаще всего ставят на предметных стёклах, так же можно ставить в чашках Петри или капиллярах. Для предметных стёкол: очищенное, обезжиренное предметное стекло заливается горячим агаром. После застывания проделываются лунки, лишний агар убирается ученическим пером или иглой, компоненты разливаются по лункам, стёкла помещаются во влажную камеру. Предварительный учёт результатов проводят через 8-10 часов, основной – через 24 часа, и окончательный – через 48 часов.

Достоинства РДП:

- простота техники постановки

- быстрота получения ответа

- нетребовательность к чистоте компонентов

- не требуется стерильности

- минимальная потребность в компонентах

- пригодность для работы с любыми растворимыми антигенами

- возможность документирования результата путём фотографии

Недостатки РДП:

- Низкая чувствительность

50. Серологические реакции как метод идентификации выделенного вируса: принцип, компоненты, учёт результатов. РИФ: принцип, варианты, задачи, компоненты, достоинства и недостатки.

В основе реакции иммунофлуоресценции (РИФ) лежит явление люминесценции, которое наблюдается в виде флуоресценции (свечения, возникающее в момент облучения возбуждающим светом). Вещества, обладающее интенсивной первичной флуоресценцией и использующиеся для придания флуоресцирующих свойств не флуоресцирующим веществам, называются флуорохромы. Такая флуоресценция называется вторичной.

Люминесцентное свечение подчиняется правилу Стокса, согласно которому свет флуоресценции имеет большую длину волны, чем свет возбуждения (возбуждающий цвет синий – флуоресценция зелёная, свет). Это позволяет отфильтровывать слабую флуоресценцию от более ярких возбуждающих лучей.

Для учёта результатов РИФ используют специальные люминесцентные микроскопы. При люминесцентной микроскопии для возбуждения флуоресценции используют ближнюю ультрафиолетовую или сине-фиолетовую часть спектра. В таких микроскопах используется система светофильтров для выделение сине-фиолетовой части спектра, теплозащитные фильтры и запирающий фильтр на окуляре (снятие возбуждающего света и пропускание света люминесценции).

Принцип РИФ заключается в том, что соединённые с флуорохромом антитела сохраняют способность вступать в специфическую связь с антигеном. Образовавшийся комплекс антиген-антитело обнаруживают под люминесцентным микроскопом по характерному свечению флуорохрома.

Антитела получат из гипериммунных высокоактивных противовирусных сывороток, максимально освобождённых от гетероантител. Из них выделяют гомогенный фракции антител, которые метят флуорохромом. Антитело, меченные флуорохромом, называются конъюгатом.

Для иследования методом РИФ используют мазки, отпечатки, гистологические срезы, культуры клеток.

Методы РИФ. Прямой метод.При использовании данного метода для индикации различных антигенов применяют соответствующие антитела, меченые флуорохромом. РИФ относится к экспресс-методам. На препарат наносят конъюгат, выдерживают 20-60 минут при 37 градусах во влажной камере. Отмывают физраствором, подсушивают, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под микроскопом.

Результаты учитывают по интенсивности и специфичности флуоресценции. Яркая, сверкающая флуоресценция изумрудно-зелёного цвета - ++++, яркая флуоресценция зелёного цвета - +++, - слабая флуоресценция жёлто-зелёного цвета - ++, очень слабая флуоресценция неопределённого цвета - +, объект не флуоресцирует – отрицательная реакция.

Прямой метод позволяет выявить и идентифицировать антиген.

Непрямой метод.При этом методе антиген сначала обрабатывают гомологичными ему нефлуоресцирующими антителами. Образовавшийся комплекс антиген-антитело обрабатывают флуоресцирующей антивидовой сывороткой, соответствующей виду животного, сыворотка которого применяется. Таким сыворотки применяют путём иммунизации животных глобулинами животных нужного вида.

На препарат наносят немеченую сыворотку с антителами к предполагаемому вирусу, в течение 30 минут выдерживают при 37 градусах. Отмывают. Наносят конъюгат антивидовой сыворотки. Выдерживают так же, как при прямом методе (20-60 мин). Препарат отмывают и исследуют под люминесцентным микроскопом.

Преимущества непрямого метода: -используется не только для обнаружения антигена, но и для выявления и титрования антител.

- Более чувствителен, чем прямой

- требует одной меченной сыворотки для обнаружения антигенов различных вирусов

Преимущества РИФ:

- Высокая чувствительность

- спецефичность

- доступность

- быстрота

- относительная простота

Недостаток:нередко даёт неудовлетворительные результаты.

Задачи, решаемые с помощью РИФ:

-Индикация и идентификация вирусов

- выявление и титрование противовирусных антител

- изучение процессов взаимодействия вирусов с клетками

- изучение динамики накопление антигенов в клетке

- Изучение антигенных связей вирусов и патогенеза вирусных инфекций

Определение серотипа вируса ящура в РСК: принцип, задачи, компоненты, учёт результатов.

Реакция связывания комплемента (РСК) состоит из двух этапов. В первом этапе участвуют антиген, антитело (один из компонентов заранее известен) и определённое количество предварительно оттитрованного комплемента. При соответствии антигена и антитела их комплекс связывает комплемент. Это выявляется на втором этапе, когда к смеси добавляют смесь эритроцитов и антисыворотки с гемолизином. Если комплемент связался комплексом антиген-антитело, то лизиса эритроцитов не произойдёт. Если комплемент не связан, разрушения эритроцитов не происходит.

Задачи, решаемые с помощью РСК:

- обнаружение и идентификация вирусов

- обнаружение и титрование антител в сыворотке крови

Компоненты РСК:

- антигены

- антитела

- комплемент

- гемолитическая сыворотка

- эритроциты (чаще всего барана)

- в качестве разбавителя – изотонический раствор NaCl

Антигены для РСК готовят из органов заражённых животных, из аллантойсной или амниотической жидкости заражённых куриных эмбрионов или из жидкой среды инфицированных культур клеток.

РСК применяется для определения типов и подтипов вируса ящура, вызывающих заболевания животных, для проверки производственных штаммов вируса ящура при изготовлении вакцин и лабораторных штаммов при научно-исследовательской работе.

Ящур –остро протекающая высококонтагиозная болезнь парнокопытных, проявляющаяся лихорадкой, везикулярным поражением слизистых оболочек рта, кожи венчика и вымени, у молодых животных поражением миокарда и скелетных мышц.

Регистрируется во многих странах мира.

Инкубационных период – 1-3 дня, иногда 7-10 дней. Самый характерный признак - везикулярное поражение слизистых оболочек рта, кожи венчика и вымени.

Вирус ящура относится к семейству Picornoviridae, роду Aphthovirus. РНК-содержащий, не имеет суперкапсидной оболочки. Не является гемагглютинирующим.

В естественных условиях к данному вирусу восприимчивы домашние и дикие парнокопытные.

Для работы с вирусом ящура в лаборатории выделяется отдельная комната сов сем необходимым оборудованием и материалами для проведения работы. При работе полностью сменяют спецодежду и обувь, надевают резиновые перчатки и маску.

При подозрении на ящур проводятся:

- обнаружение и идентификация антигена вируса ящура в РСК (его типовая вариантная принадлежность)

- обнаружение и титрование антител к вирусу ящура у переболевших животных

Для постановки РСК на вирус ящура необходимы:

- испытуемые антигены (от больных животных)

- сыворотки морских свинок, гипериммунизированных стандартными и вариантными штаммами вируса

- контрольные антигены (стандартные и вариантные штаммы вируса)

- комплемент (свежая или сухая нормальная сыворотка морских свинок)

- взвесь эритроцитов барана в физрастворе

- раствор NaCl на дистиллированной воде

- набор специфических сывороток и антигенов к другим вирусам

Компоненты разливают в следующем порядке:

1) Специфические сывортки в рабочем титре по 0,2 мл для каждой – один ряд пробирок по вертикали

2) Специфические антигены в рабочем титре по 0,2 мл – первые семь рядов по горизонтали (для каждого один ряд)

3) Испытуемые антиген в разведения по 0,2 мл – для каждого разведения один ряд по горизонтали

4) Физраствор по 0,2 мл – в последний ряд по горизонтали вместо антигена и в последний ряд по вертикали вместо сывороток

5) комплемент по 0,2 мл в рабочем разведении – во все пробирки

Пробирки осторожно встряхивают и помещают в водяную баню на 20 минут при 37-38 градусах.

6) Во все пробирки наливают по 0,4 мл гемолитической системы.

Снова встряхивают и помещают в водяную баню на 30 минут при 37-38 градусах.

Учёт реакции ведут через 5-10 минут после водяной бани и окончательный результат получают через 10-12 часов. Степень задержки гемолиза оценивают в крестах: ++++ - 100%; +++ - 75%; ++ - 50%; + - 25%, полный гемолиз – отрицательная реакция.

Если антиген гомологичен специфическим антителам, происходит задержка гемолиза. Если гомологичные антитела отсутствуют, то реакция отрицательная – происходит гемолиз.

При производственной необходимости после определения типовой принадлежности вируса ящура устанавливают его подтип (вариант). Для этого ставят РСК по той же методике, но используют вариантные сыворотки и антигены установленного типа, причём вариантные сыворотки используются в предельном титре, а антигены – в удвоенном.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: