Количественное определение активности амилазы слюны способом Вольгемута

Лабораторное занятие 5. Ферменты.

Количественное определение активности ферментов.

Из курсов химии известно, что катализ – процессвозбуждения и ускорения химических реакций, а термин ингибитор (лат. inhibire – угнетать) – несет обратный смысл.

Функция катализаторов состоит в реакциях с исходными веществами = субстратами, с образованием промежуточных соединений в новых переходных состояниях, способных: образовать продукты при сниженной энергии активации и регенерировать катализатор. Поэтому катализатор участвует в реакции многократно и в стехиометрии реакций = количественном соотношении их компонентов, его нужно гораздо меньше, чем субстратов. Механизмы химического и биологического катализа принципиально одинаковы, но в физиологических условиях водных растворов, ферменты гораздо эффективней (табл. 1), т.к. намного больше снижают свободную энергию переходного состояния и имеют ряд других преимуществ.

Таблица 1

Сравнение свойств катализаторов (по А. Lehninger, 1974, с изменениями)

Причины высокой эффективности биокатализа суммирует схема (рис. 1). Очевидно, что относительное пространственное соответствие функциональных групп, позволяет без затрат энергии связать субстрат(ы), сразу в нескольких точках активного центра Е. Образование фермент-субстратного комплекса вызывает ряд множественных эффектов. Так, межмолекулярные отношения сменяются внутримолекулярными, а гетерогенный катализ – гомогенным, изолируя субстрат от водной среды. Параллельно индуцируется полная комплементарность между функциональными группами Е и субстрата (D. Koschland), что в свою очередь, деформирует в последнем ковалентные связи и оптимизирует возможности полифункционального катализа.

Рис. 1. Схема множественности эффектов биокатализа

Из-за отсутствия специфических индикаторов, о наличии и каталитической активности Е судят во времени, по скорости убывания субстрата или нарастания количества продукта. В системе СИ основной каталитической единицей принят катал (символ – кат.), т.е. способность ускорять реакцию на 1 моль/с, в заданной системе измерения активности. Так как для практических целей эта единица слишком велика, обычно используют ее степенные производные: микрокатал (мк-кат = 1 мкмоль/с), нанокатал (нкат = 1 нмоль/с) и пикокатал (пкат = 1 пмоль/с). К производным величинам относят: удельную и молярную каталитическую активности, соответственно, кат/кг ферментного препарата и кат/моль Е.

Хотя комиссия по номенклатуре Международного биохимического союза не рекомендует применять международные единицы активности Е, связанные с именами разработчиков систем их тестирования, например единицы Вольгемута для амилазы и т.п., они еще встречаются в литературе. Для пересчета их в систему СИ и обратно, полезны эмпирические формулы:

Благодаря высокой избирательности и активности, Е, в частности микроорганизмов, издавна широко применялись в таких традиционных биотехнологиях, как хлебопечение, сыро- и виноделие, выделка кож и тканей, компостирование и т.д. Появление методов количественного анализа Е, а потом индивидуальных и сопряженных индикаторных ферментных реакций, обеспечило точный количественный экспресс-анализ метаболитов для лабораторной и промышленной диагностики. Наконец, совершенствование методов иммобилизации Е в мицеллах, гелях т.д., привело к новым биотехнологиям, связанным с их применением в колонках, проточных реакторах и пленочных = мембранных электродах.

Дополнительная литература

1. Номенклатура ферментов. – М.: ВИНИТИ, 1979. – 320 с.

2. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. – М.: Высшая школа, 1980. – 272 с.

3. Скоупс Р. Методы очистки белков. – М.: Мир, 1985. – 358 с.

4. Варфоломеев С. Д., Гуревич К. Г. Биокинетика. – М.: ФАИР-ПРЕС, 1999. – 720 с.

5. Плакунов В.К. Основы энзимологии. – М.: Логос, 2001. – 128 с.

6. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. – М.: Мир, 1989. В 2-х томах.

7. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. – М.: Мир, 2002. – 589 с.

Экспериментальная часть

Амилаза слюны (КФ 3.2.1.1) – простая и доступная модель, для освоения основных приемов работы с Е. Соответственно схеме (рис. 2), в физиологических условиях она ведет ступенчатый эндогидролиз α-1,4-гликозидных связей в полиозах. Об этом можно судить по убыли реакции с йодом или нарастанию восстанавливающей способности сахаров, содержащих свободный полуацетальный гидроксил, например, с помощью качественных реакций Троммера, Бенедикта и др.

Рис. 2. Схема ступенчатого гидролиза полиоз под действием эндоамилаз слюны и поджелудочной железы

1. Получение разведенного препарата амилазы слюны

1. Студент-доброволец или дежурный, ополоснув рот водой 2-3 раза, собирает в пробирку с воронкой до 4 мл слюны.

2. Под контролем лаборанта, отобрать точно 3 мл слюны из пробирки и перенести в мерный цилиндр на 50 мл.

3. Избегая вспенивания, осторожно добавить в цилиндр воды до метки 30 мл и перемешать раствор стеклянной палочкой.

4. Слить, а при необходимости фильтровать раствор в стакан, отметив разведение слюны в 10 раз.

Количественное определение активности амилазы слюны способом Вольгемута

Принцип метода: Основан на последовательном разведении препарата амилазы водой с помощью «переката», после чего во все пробирки добавляют равные количества субстрата: раствора крахмала и инкубируют их при постоянной температуре. Окончив инкубацию, останавливают процесс гидролиза и, с помощью раствора йода, как индикатора на крахмал, выявляют наличие субстрата в пробирках. Зависимость между этими величинами (Жеребцов и др., 2002) сведена в таблицу:

Ход работы: 1. В соответствии с протоколом опыта, оформленным в виде таблицы:

в 10 пронумерованных пробирок разлить точно по 1 мл воды.

2. Добавить в первую пробирку 1 мл слюны с разведением в 10 раз и, избегая вспенивания, хорошо перемешать раствор с помощью пипетки.

3. Той же пипеткой перенести 1 мл содержимого из первой пробирки во вторую, из второй – в третью и т.д., каждый раз, тщательно перемешивая их содержимое. Закончив «перекат», удалить из последней (десятой) пробирки 1 мл смеси.

4. Во все пробирки с полученной серией разведений слюны добавить точно по 2 мл 0,1 % раствора крахмала, тщательно перемешивая их содержимое.

5. Пометить свой штатив и поместить его в водяную баню с качалкой при 40 С (313 К), оставив для инкубации точно на 30 мин.

6. По истечении времени инкубации, вынуть свой штатив с пробирками из бани и, тут же охладить его водой из под крана, в течение 1-2 мин.

7. В каждую пробирку добавить по 1-2 капли раствора Люголя (1 % раствор йода в 2 % растворе иодида калия), в качестве индикатора на крахмал.

8. Содержимое пробирок перемешать и, наблюдая развитие окраски, занести результаты в таблицу протокола опыта.

9. Рассчитать активность амилазы (Е/л) в пробах по следующей формуле:

а – разведение слюны в последней пробирке с желтой окраской;

0,002 – количество грамм крахмала в пробе;

1000 – коэффициент пересчета миллилитров в 1 л;

30 – время инкубации в минутах;

60 – коэффициент пересчета минут в секунды.

10. Занести результаты расчетов в таблицу протокола.

В норме, активность амилазы в слюне человека 3-7 нкат/л. Однако, существенной диагностической ценности она не имеет.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: