Результаты и их интерпретация

Культуры, которые образовывают пигмент и на свету и в темноте – скотохромогенные.

Культуры, которые не образовывают пигмент в темноте, но становятся желтыми или оранжевыми после световой экспозиции – фотохромогенные.

Культуры, которые не образовывают пигмент на свету и в темноте, относятся к нефотохромогенным.

Только один вид M szulgai может быть фотохромогенным при 25°C и скотохромогенным при 37°C.

Основные тесты для идентификации M. tuberculosis

В лабораторной практике используются культуральные и биохимические методы исследования микобактерий. Для правильной оценки выделенных микобактерий необходимо использовать комплекс методов.

Биохимические методы идентификации микобактерий

Ниациновый тест

Ниациновый тест является основным тестом, используемым для идентификации M.tuberculosis.

Принцип метода. Ниацин (производное никотиновой кислоты) играет чрезвычайно важную роль в осуществлении всех окислительно-восстановительных реакций, происходящих в клетках кислотоустойчивых микобактерий. Ниацин продуцируют все микобактерии, однако исследования показали, что у M. tuberculosis в результате блокирования ряда метаболических путей никотиновая кислота накапливается в больших количествах, во много раз превышающих ее содержание в клетках микобактерий других видов. Штаммы M. tuberculosis, не продуцирующие ниацин, встречаются очень редко.

Ниациновый тест не должен использоваться как единственный для идентификации M. tuberculosis, так как отдельные штаммы M. bovis, в том числе и субштаммы BCG, а также некоторые виды нетуберкулезных микобактерий (M. simiae, M. chelonae chemovar niacinogenes) обладают относительно высокой способностью синтезировать ниацин и давать положительную реакцию.

Ниациновая проба основана на том, что продуцируемая микобактериями никотиновая кислота, вступая в реакцию с цианистыми соединениями, дает ярко-желтое окрашивание.

Ниациновый тест дает наиболее убедительные результаты в тех случаях, когда для его постановки используют колонии, выросшие на яичной среде, поэтому и рекомендуется применять среду Левенштейна-Йенсена. Возраст культур должен быть не менее 3–4 недель, причем для постановки ниацинового теста необходимо использовать пробирки с ростом не менее 50 колоний. Так как растущие колонии M. tuberculosis выделяют ниацин в питательную среду, посевы со сливающимися колониями могут давать ложноотрицательные результаты, так как экстрагирующая жидкость в этом случае не может контактировать с питательной средой. При наличии сливающихся колоний для обеспечения контакта жидкости с питательной средой необходимо либо снять и удалить часть колоний, либо проколоть поверхность среды.

Реакция требует свободного доступа кислорода на протяжении всего исследования, поэтому следует пользоваться либо ватно-марлевыми пробками, либо специальными металлическими колпачками, обеспечивающими свободный доступ воздуха в пробирку.

Ниациновый тест можно выполнять либо с растворами химических реактивов, приготавливаемыми непосредственно перед постановкой пробы, либо с заранее приготовленными в лабораторных условиях или коммерческими бумажными полосками.

Ниациновый тест с растворами химических реактивов требует соблюдения максимальной осторожности, так как цианистые соединения чрезвычайно токсичны при ингаляции паров и вызывают слезотечение, а анилин обладает онкогенным воздействием и способен проникать через кожный барьер. Эти обстоятельства ограничивают применение ниациновой пробы с растворами химических реактивов.

В большинстве бактериологических лабораторий для постановки ниациновой пробы пользуются специально приготовленными бумажными полосками. Преимущество этого варианта метода заключается в использовании вместо цианистых соединений роданистого калия – вещества более безопасного и доступного, а также в быстроте реакции, позволяющей через 3–4 часа получить ответ о принадлежности выделенной на плотной питательной среде культуры к микобактериям человеческого вида или к другим микобактериям.

Следует иметь в виду, что из-за нестабильности растворов и реагентов необходимо строго соблюдать правила хранения и сроки использования как растворов и реагентов, так и бумажных полосок. В сомнительных случаях реагенты и полоски должны сравниваться со свежеприготовленными.

Ниациновый тест с бумажными полосками

Реактивы для нанесения на бумажные полоски:

Раствор 1. 20% раствор ПАСК (парааминосалициловой кислоты)

В пробирку с 1,75 мл 96° этанола добавляют 0,25 мл диметилсульфоксида и 400 мг ПАСК. Смесь подогревают на водяной бане при 56°С в течение 5–10 минут при периодическом встряхивании до полного растворения ПАСК.

Раствор 2. 60% раствор роданистого калия Навеску 1,5 г роданистого калия растворяют в пробирке с 2,5 мл 8% раствора лимонной кислоты (200 мг лимонной кислоты и 2,5 мл дистиллированной воды).

Раствор 3. 50% раствор хлорамина "Б" 3,125 г хлорамина "Б" растворяют в 6,25 мл дистиллированной воды на водяной бане при температуре 56–60°С при периодическом встряхивании.

Индикаторные бумажные полоски готовят из фильтровальной бумаги Filtrak 11 или аналогичной. Один конец полоски отмечают простым карандашом. Оттянутыми пастеровскими или автоматическими пипетками на полоски наносят по 1 капле свежеприготовленных растворов в следующем порядке:

− 20% раствор ПАСК – на отмеченный карандашом конец полоски;

− 60% раствор роданистого калия – на середину полоски;

− 50% горячий раствор хлорамина "Б" – на свободный конец полоски.

Между каплями должны оставаться сухие промежутки.

Индикаторные полоски высушивают в темноте при комнатной температуре в течение 24 часов. Затем для получения более четких результатов наносят повторно 1 каплю хлорамина "Б" на уже высохшую каплю этого раствора. Полоски вновь высушивают, помещают в пробирки, закрывают резиновыми пробками и хранят в холодильнике. Полоски пригодны к употреблению в течение 3 месяцев.

Методика

Добавляют в пробирку с исследуемой культурой 1,0 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия или дистиллированной воды. Кладут пробирку горизонтально, чтобы жидкость покрыла всю поверхность питательной среды, оставляют на 30 минут для экстракции ниацина. Время экстракции может быть увеличено, если колоний слишком мало.

Пробирки ставят в вертикальное положение на 5 минут, чтобы вода полностью стекла на дно. Переносят 0,5 мл экстракта в чистую пробирку с завинчивающейся крышкой.

Индикаторную полоску помеченным карандашом концом (на который нанесен ПАСК), опускают с помощью пинцета в пробирку с экстрактом, не допуская смачивания экстрагирующей жидкостью средней части полоски, оставляют при комнатной температуре на 15—30 минут. Допустимо слегка встряхивать пробирку, но не переворачивать ее.

Наблюдают появление желтого окрашивания на дне пробирки на белом фоне. Любая окраска индикаторной полоски не принимается во внимание, так как ее появление может быть вызвано окислением реактивов в верхней части полоски.

Для дегазации пробирок после проведения реакции пользуются 10% раствором нашатырного спирта, 10% раствором едкого натра или любым щелочным дезинфицирующим средством.

Результаты и их интерпретация

Положительный результат - экстракт окрашивается в желтый цвет разной интенсивности.

Отрицательный результат - нет окрашивания жидкости.

Нитратредуктазный тест

Принцип методазаключается в определении активности нитратредуктазы по количеству восстановленного нитрита из нитрата, что сопровождается цветной реакцией с парадиметиламинобензальдегидом. Реакция восстановления нитратов дает возможность дифференцировать микобактерии человеческого вида, обладающие нитратредуктазой, от микобактерий бычьего и птичьего видов и от некоторых нетуберкулезных микобактерий, у которых этот фермент отсутствует. Из всех микобактерий нитратредуктазная активность наиболее выражена у M. tuberculosis. Это позволяет использовать данный тест в сочетании с ниациновым тестом для дифференциальной диагностики M. tuberculosis и микобактерий других видов. Для определения способности микобактерий редуцировать нитраты используют 4-х недельные культуры с обильным ростом, выращенные на среде Левенштейна-Йенсена.

Классический метод

Приготовление реактивов:

Раствор 1.Нитрат натрия в фосфатном буфере.

0,01 М раствор нитрата натрия в 0,022 М фосфатном буферном растворе (рН 7,0) готовят следующим образом:

А. 3,02 г КН₂РО₄ растворяют в 1000 мл дистиллированной воды;

Б. 3,16 г Na₂НРО₄ растворяют в 1000 мл дистиллированной воды;

В. 611 мл раствора Б добавляю к 389 мл раствора А, хорошо смешивают (рН раствора 7,0).

В 1000 мл полученного буферного раствора (В) растворяют 0,85 г NaNО₃.

Разливают полученный раствор 1 в емкости по 100 мл. Стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. При необходимости этот раствор можно переносить по 2 мл в пробирки с завинчивающимися крышками.

Раствор 2.Раствор соляной кислоты

Концентрированная соляная кислота - 10 мл

Дистиллированная вода - 10 мл

Медленновливают концентрированную соляную кислоту в дистиллированную воду, чтобы получить разведение 1:1. Никогда не вливайте воду в кислоту!

Раствор 3. Раствор сульфаниламида (0,2%).

Сульфаниламид - 0,2 г

Дистиллированная вода - 100 мл

Растворяют сульфаниламид в дистиллированной воде. Полученную смесь хранят в герметически закрытой бутыли из темного стекла в холодильнике.

Раствор 4. Раствор N-нафтилэтилендиамина (0,1%).

N-нафтилэтилендиамин - 0,1 г

Дистиллированная вода - 100 мл

Растворяют нафтилэтилендиамин в дистиллированной воде. Полученную смесь хранят в герметически закрытой бутыли из темного стекла в холодильнике.

Контроль реактивов

Перед выполнением теста необходимо проконтролировать пригодность реактивов:

отрицательный контроль –тест с экстрактом из пробирки с незасеянной средой;

положительный контроль–тест с экстрактом референс-штамма M. tuberculosis H37Rv.

Методика

0,2 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия вносят в пробирку с завинчивающейся крышкой. С помощью стерильной бактериологической петли или лопатки суспендируют в этом растворе четырехнедельную культуру микобактерий (две лопатки биомассы бактерий).

Добавляют 2 мл раствора 1 (раствор нитрата натрия в буфере), хорошо встряхивают и оставляют на 3 часа в водяной бане при температуре 37°С.

Добавляют в следующем порядке:

1 каплю разведенной соляной кислоты (раствор 2), хорошо встряхивают пробирку;

2 капли 0,2% раствора сульфаниламида (раствор 3);

2 капли 0,1% раствора N-нафтилэтилендиамина (раствор 4);

Немедленно контролируют появление розового или красного окрашивания, сравнивая его интенсивность с цветовым стандартом.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: