инструментов к стерилизации

Практическое занятие № 2

Стерилизация. Методы стерилизации. Подготовка посуды и

инструментов к стерилизации

Цель занятия.Ознакомиться с принципами и методами стерилизации, освоить правила подготовки посуды и инструментов к стерилизации.

Полное освобождение любого материала от живых микроорганизмов и их покоящихся форм называется стерилизацией,или обеспложиванием.В основу различных методов стери­лизации положена способность определенных факторов вызывать гибель микроорганизмов и их спор. Агенты, вызывающие гибель микробных клеток, называются бактерицидными. В качестве стерилизующих используются, те из них, для которых не возникает необходимость последующего их удаления с обрабатываемого материала. К таким агентам относятся высокая температура, лучевая энергия, летучие химические соединения. Жидкости можно освободить от микробов фильтрованием.

Стерилизация под действием высоких температур. Наиболее часто для стерилизации используют высокие температуры, вызывающие гибель клеток микроорганизмов. Действие на микроорганизмы низких температур (-190°С в жидком азоте или -252 °С в жидком кисло­роде) не вызывает значительных изменений в их клетках.

Эффективность бактерицидного действия температуры зависит от степени нагревания, продолжительности воздействия, вида микроорганизма, а также от состава среды, в которой он находится. Для уничтожения вегетативных форм большинства микробов достаточно температуры в пределах 61,5 - 85 °С и экспозиции соответственно от 30 до 3 мин. Споры бактерий погибают при температуре выше 100 °С. При снижении влажности устойчивость бактерий и их спор к высоким температурам повышается. Так, в условиях влажного жара споры гибнут при 110 - 120 °С в течение 20 - 30 мин, а в условиях сухого жара - при 180 °С и экспозиции 45 мин.

Микроорганизмы существенно отличаются по чувствительности к действию температуры, что можно объяснить различной организацией их клеток и, прежде всего их оболочек. Так, необратимые процессы в клетках пневмококков начинаются при температуре 45 - 50 °С, а в клетках стафилококков - при 60 - 70 С. В то же время ряд термофильных бактерий Methanobacterium thermoautotrophicum, Thermoactinomyces vulgaris и других вегетируют при температуре 60 - 70 °С и даже при более высоких. Гибель микроорганизмов под воздействием высоких температур наступает вследствие денатурации клеточных белков. Помимо этого высокие температуры разрушают осмотический барьер клеток, нарушают равновесие ферментативных реакций и т. д.

Стерилизация под воздействием высоких температур может осуществляться различными способами: прокаливанием в пламени горелки, кипячением, пастеризацией, сухим жаром, влажным жаром, насыщенным паром под давлением (автоклавирование).

Прокаливанием в пламени горелки (фламбированием) стерилизуют бактериологические петли, бактериологические иглы, пинцеты, ножницы, и некоторые другие металлические предметы. В микробиологической практике часто пользуются бактериологической петлей, которая служит для забора микробного материала. Изготавливается бактериологическая петля из платиновой или нихромовой проволоки длиной 8—10 см, один конец которой загнут в виде круга, другой закрепляется в специальном металлическом держателе.

Стерилизацию кипячением производят в стерилизаторе на слабом огне, чтобы избежать разбрызгивания жидкости. Началом стерилизации считается момент закипания воды в стерилизаторе. По окончании кипячения воду сливают, и инструменты берут стерильным пинцетом. Кипячением стерилизуют шприцы (в разобранном виде), металлические инструменты (ножницы, скальпели, пинцеты), резиновые перчатки и пробки, некоторые другие предметы. Инструменты, содержащие металлические части, стерилизуют в 2 %-м растворе гидрокарбоната натрия, который предупреждает появление ржавчины.

Пастеризация (неполная стерилизация). Пастеризацией называется уничтожение в материале только вегетативных клеток микроорганизмов. С этой целью его подвергают воздействию температуры 75 - 80°С в течение 5 - 10 мин. Пастеризуют чаще всего продукты питания (молоко, соки, ягоды, фрукты, вина и т. д.), которые при воздействии более высоких температур теряют свои вкусовые и пищевые качества. При пастеризации гибнут споры грибов, вегетативные клетки бактерий, в том числе и патогенных, тогда как бактериальные эндоспоры остаются жизнеспособными. Их прорастанию при хранении продуктов препятствуют низкие значения рН, высокие концентрации сахара, отсутствие кислорода и некоторые другие факторы.

Стерилизация сухим жаром осуществляется в сушильных шкафах. Наиболее часто в лабораториях используется электрический сушильный шкаф 2В-151. Он состоит из корпуса, в котором находится цилиндрическая рабочая камера. В камере расположены съемные рабочие полки. Шкаф обогревается при помощи нагревательной проволоки, намотанной на термостойкую миконитовую пластинку, находящуюся на наружной поверхности камеры. Пространство между стенками корпуса и рабочей камеры заполнено термоизоляционным материалом. В шкаф вмонтирован термометр. Обогрев регулируется при помощи автоматического терморегулятора.

Максимальная температура в сушильном шкафу достигает 200 °С. Горячим воздухом в сушильном шкафу чаще всего стерилизуют стеклянную посуду (пробирки, воронки, пипетки, стаканы, колбы, шприцы и т. д.). Перед стерилизацией посуду тщательно моют и сушат. При стерилизации споры бактерий переносят высокую температуру в течение длительного времени.

Обычно продолжительность стерилизации при температуре 160 °С - 2 ч, при 165 - 1 ч, при 180 - 40 мин, а при 200 °С – 10 -15 мин. Следует иметь в виду, что при температуре 170 °С бумага и вата желтеют, а при более высоких температурах обугливаются. По окончании стерилизации сушильный шкаф выключают, но дверцы его не открывают до полного охлаждения, так как холодный воздух, поступающий внутрь шкафа, может вызвать образование трещин на горячей посуде.

Стерилизация влажным жаром (текучим паром) производится в аппарате Коха или в автоклаве при открытом выпускном кране. Аппарат Коха представляет собой металлический полый цилиндр с двойным дном и электронагревательным устройством. Пространство между верхней и нижней пластинками дна заполняется на 2/3 водой. В крышке аппарата вмонтирован термометр и имеется отверстие для выхода пара. В аппарате Коха стерилизуют питательные среды, свойства которых изменяется при температурах выше 100 °С.

Обработку материала текучим паром используют для проведения дробной стерилизации (тиндализации). При этом материал, чаще всего питательные среды, подвергается трех- или четырехкратной обработке влажным жаром в течение одного часа при температуре 56 - 75 °С с интервалами 24 ч, в течение которых поддерживается температура, благоприятная для прорастания спор. Проросшие из спор вегетативные клетки быстро погибают при очередном назревании материала.

Стерилизация влажным жаром под давлением (автоклавирование) основана на прогревании материала насыщенным паром при давлении выше атмосферного (рис.1). Известно, что температура насыщенного пара зависит от давления - с повышением давления его температура возрастает. Так как с повышением давления температура кипения жидкостей повышается, появляется возможность стерилизовать их при 100 °С и выше, не допуская кипения, испарения и разбрызгивания. Продолжительность стерилизации паром под давлением зависит от химического состава стерилизуемого материала, видов микробов, находящихся в нем, а также от объема сосудов, в которых проводят стерилизацию. Условия повышенного давления насыщенного пара создают в специальных герметически закрывающихся толстостенных аппаратах - автоклавах.

Они бывают различной конструкции, но принципиальная схема их устройства одна и та же (Рис.1).

Б.

Рис.1 Автоклав -А; схема автоклава:

1 — стерилизацианная камера; 2— кран для выхода воздуха; 3 — манометр; 4 — предохрани­тельный клапан; 5 — водопаровая камера; 6 — воронка для заполнения автоклава водой; 7— отверстия для поступления пара в стерилизационную ка­меру; 8 — крышка автоклава; 9 — подставка для размещения стерилизуемых материалов.

Автоклав состоит из двух камер - большой (рабочая или стерилизационная) и маленькой (водопаровая), сообщающихся между собой трубопроводом с вентилем. Водопаровая камера сообщается также с внешней средой трубкой с водомерным стеклом, краном и воронкой, через которую она заполняется дистиллированной водой. Рабочая камера, в которую помещают стерилизуемый материал, снабжена краном для выхода воздуха, манометром для определения давления пара и предохранительным клапаном для выхода пара при чрезмерном повышении давления.

Нагревание воды в водопаровой камере осуществляется с помощью вмонтированных в нее электродов и регулируется автоматически. Началом стерилизации считается тот момент, когда стрелка манометра показывает заданное давление. Это давление поддерживают путем регулирования подогрева. По окончании времени стерилизации подогрев прекращают. Автоклав отключают и дожидаются, когда давление в автоклаве сравняется с атмосферным. Затем открывают кран, выводящий пар. Только после падения давления до нуля и выхода пара медленно открывают крышку автоклава. Для работы с автоклавом допускаются лица, прошедшие специальное обучение.

Проверка эффективности тепловой стерилизации. Контроль температуры в автоклавах можно осуществлять при помощи специальных термоиндикаторов - термочувствительных красок, изменяющих окраску после воздействия стерилизующей температуры, или веществ (сера, сахар), плавящихся только при определенных температурах.

Контроль эффективности бактерицидного действия высоких температур осуществляют, помещая вместе с материалом, подлежащим стерилизации, полоски бумаги, на которые нанесены споры устойчивых к нагреванию бактерий, например, Bacillus subtilis или ампулы, содержание споры В. stearothermophilus, которые относятся к числу наиболее термоустойчивых. После окончания стерилизации полоски бумаги или ампулы помещают в условия, благоприятные для прорастания спор.

Стерилизация фильтрованием. Многие компоненты жидких питательных сред термолабильны и быстро разрушаются под воздействием высоких температур. Поэтому жидкие питательные среды и их компоненты удобнее всего стерилизовать фильтрованием. Впервые стерилизация жидкостей фильтрованием была проведена Шамберланом, учеником Л. Пастера. Он изготовил фарфоровый фильтр, представляющий собой полый цилиндр, закрытый с одного конца и напоминающий свечу - свеча Шамберлана. Фильтр задерживает самые мелкие из всех известных бактерий. Стенки свечи Шамберлана состоят из глинозема, фарфора или кизельгура. Эти материалы несут положительный электрический заряд, в то время как бактерии заряжены отрицатeльнo. Таким образом, механизм фильтрации через свечи заключается не в «просеивающем» их действии, а носит адсорбирующий характер. К адсорбирующим относятся также фильтры, изготовленные из глины, асбеста и некоторых других материалов. Поры этих фильтров больше, чем размеры бактерий.

В микробиологической практике широко применяются асбестовые и стеклянные фильтры. Асбестовые фильтры представляют собой пластинки толщиной 3—5 мм и диаметром 35 и 140 мм. (стерилизующий фильтр). Перед употреблением асбестовые пластинки монтируют в специальный фильтровальный аппарат – прибор Зейтца, состоящий из двух частей, металлического или стеклянного полого цилиндра и нижней части с опорной сеткой. На опор­ную сетку кладут асбестовый фильтр и обе части аппарата сое­диняют винтами или зажимами. На трубку нижней части аппара­та одевается резиновая пробка, посредством которой он вставля­ется в колбу Бунзена. Приготов­ленный таким образом прибор Зейтца обертывают в бу­магу и стерилизуют в автоклаве. Стерилизуемую жид­кость наливают в цилиндр и соединяют боковой отро­сток колбы Бунзена с вакуум-насосом. В результате образующейся разности давлений жидкость проходит че­рез асбестовый фильтр в колбу. В аппарат Зейтца могут монтироваться также стерилизующие стек­лянные и мембранные фильтры (рис. 2).

Рис. 2 Приборы для стерилизации фильтрованием:

А— со стеклянным держателем; Б — с металлическим держателем

Мембранные фильтры изготавливают из ацетата цел­люлозы или нитроцеллюлозы. Они представляют собой тесное переплетение волокон. Метод их изготовления позволяет кон­тролировать максимальный размер частиц, проходящих через фильтр. Поры фильтров имеют неправильную фор­му и занимают примерно 80 % площади. Диапазон максимальных размеров задерживаемых частиц в зави­симости от номера фильтра может варьировать от 0,01 до 8,0 мкм. Размеры пор стерилизующей мембраны составляют 0,22 мкм. Мембранные фильтры представляют собой диски белого цвета, по внешнему виду напоминающие глянцевую бумагу.

Непосредственно перед применением мембранные фи­льтры, установленные в фильтродержатель стерилизуют кипячением. После этого в стерильных условиях монтируют в специальные филь­тровальные аппараты, в том числе и аппарат Зейтца. Для стерилизации фильтрованием небольших объемов жидкости удобно использовать стерильные, готовые к применению одноразовые шприцевые насадки.

В настоящее время для стерилизации применяются также молекулярные фильтры, которые отделяют малые макромолекулы от больших и эффективно задерживают вирусные частицы. Диапазон молекулярных масс пропускаемых молекул варьирует в пределах от 500 до 100 000 дальтон.

Стерилизация облучением. На клетки бактерий лета­льный эффект оказывают ультрафиолетовые, рентгенов­ские, гамма-, альфа-, бета- лучи и нейтроны. В лаборатор­ных условиях обычно используют ультрафиолетовые лучи, источником которых являются специальные бакте­рицидные лампы. Излучателем в них служит электричес­кая дуга, возникающая в парах ртути низкого давления и испускающая линейчатый спектр в ультрафиолетовой об­ласти, более 80 % энергии которого приходится на длину волны 253,7 нм. Бактерицидные лампы используют для стерилизации открытых поверхностей и возду­ха помещений (операционные, хирургические отделения, родильные дома, микробиологические боксы и др.) не менее чем за 30 минут до начала работы. Вегетативные формы бактерий более чувствительны к ультрафиолетовому облучению, чем споры, которые в 3— 10 раз более устойчивы. Следует помнить, что ультра­фиолетовые лучи обладают мутагенным действием, могут вызвать острое воспаление роговицы глаз. Поэтому необходимо применять при работе с кварцевыми лампами защитные очки.

Химическая стерилизация (дезинфекция). Дезинфек­ция представляет собой удаление или разрушение патогенных микроорганизмов, находящихся на неживых объ­ектах или поверхностях, с помощью химических агентов, получивших название дезинфицирующих веществ. Де­зинфекция проводится в тех случаях, когда невозможно применить стерилизацию паром или другими физически­ми методами, например, когда имеют дело с большими пространствами, большими поверхностями и стационар­ным оборудованием.

Бактерицидное действие химических агентов обуслов­ливается активностью функциональных групп, концен­трацией активного компонента данного вещества, дли­тельностью контакта, рН, температурой, влажностью и присутствием органического вещества.

В качестве дезинфицирующих агентов применяются галогены, фенол и их производные, соединения тяжелых металлов, спирты, микробоцидные газы и др.

Галогены и их производные. При хими­ческой стерилизации наиболее часто применяют хлор, йод и их производные. В качестве основы хлорных де­зинфицирующих средств используют гипохлорит натрия. Широкое применение находят хлорамины. В лабораторных условиях широко использу­ют спиртовый раствор (настойка) йода или его производ­ное (йодофор-вескодин). Хлор и йод активны против всех бактерий и их покоящихся форм — спор. При работе с соединениями хлора и йода необходимо помнить, что они имеют тенденцию выделяться из растворов, придают им неприятный запах и ядовиты для тканей макроорганизма.

Для дезинфекции могут быть использованы соеди­нения тяжелых металлов— ртути, серебра, меди. Однако поскольку препараты из ртути (хлорид рту­ти (II), оксицианид ртути) токсичны, а содержащие се­ребро дорогостоящи и оказывают в большей степени бактериостатическое, чем бактерицидное действие, их не рекомендуется использовать для дезинфекции.

Фенольные соединения, например о-фенилфенол, эффективны против вегетативных клеток бактерий в больших разведениях и практически лишены запаха. Фенол оказывает дезинфицирующее действие на вегета­тивные клетки и споры бактерий, однако в силу неприят­ного запаха применяется редко. Фенольные соединения неэффективны против бактериальных спор.

Спирты, как и фенолы, содержат в своей молекуле гидроксильные группы, которые придают им бактерицидные свойства. Для дезинфекции используются только этиловый и изопропиловый спирты. Их дезинфицирующие свойства приблизительно одинаковы и увеличиваются прямо пропорционально концентрации от 50 до 70°. При более высоких концентрациях бактерицидное действие спиртов резко снижается. Абсолютный этиловый спирт практически лишен летального действия на клетки бактерий. Спирты не вызывают гибели спор и обладают медленным обеззараживающим действием (несколько минут).

Микробоцидные газы. К стерилизующим га­зам относятся формальдегид, окись этилена и пропиолактон. Формальдегид обладает выраженной спороцидной активностью. Максимальный стерилизующий эффект достигается при относительной влажности 70 % и температуре 22 °С. При низких температурах формальдегид теряет дезинфицирующую активность. К его недостаткам следует отнести токсичность, острый, раздражающий запах и способ­ность образовывать на поверхности стерилизуемого органического материала слой свернувшегося вещества, который защищает находящиеся внутри микроорганизмы.

Окись этилена используется для дезинфекции в виде га­зовой смеси, в которой на ее долю приходится от 2 до 50 %, вторым компонентом смеси является азот или угле­кислота. Окись этилена эффективно убивает вегетативные клетки и споры бактерий. Ее применяют для стерилизации питательных сред, содержащих термолабильные компоненты, пластмассовых чашек Петри и других предметов, которые плавятся при температуре выше 100°С. Окись этилена достаточно летуча, ее можно легко удалить с обрабатываемых объектов путем кратковременного нагревания их до 37 °С.

Необходимо помнить, что окись этилена нестойка и распадается в водных растворах, образуя этиленгликоль, который может вызвать нежелательные эффекты. Поми­мо этого окись этилена взрывоопасна и токсична для че­ловека.

β-пропиолактон при температуре 20 °С представляет собой жидкость со сладковатым раздражающим запахом. В водных растворах нестоек. Это соединение вызывает гибель большинства микроорганизмов и их спор. Действие его обуславливается связыванием с белками, жирными кислотами и углеводами клетки. β-пропиолактон применяют для стерилизации термолабильных питательных сред, вакцин, сывороток и других нестойких биологических материалов. Обычно в соответствующую среду добавляют 0,2% жидкого пропиолактона и выдерживают при 25°С в течение 2-3 ч. В течение последующих нескольких часов находящийся в среде β-пропиолактон полностью разлагается. Обработку β-пропиолактоном различных предметов и помещений необходимо проводить в условиях относительной влажности 70-80% и концентрации его в воздухе 2-4 мг/мл. β-пропиолактон обладает раздражающим и канцерогенным свойствами, в связи с чем при работе с ним необходимо соблюдать соответствующие меры предосторожности во избежание попадания его внутрь организма.

Задание: 1. Прочитать теорию вопроса, составить таблицу:

Таблица - «Классификация методов стерилизации»

2. Подготовить к стерилизации пипетки и чашки Петри.

При подготовке к стерилизации пипе­ток в их верхнюю часть вложить комочек ваты, предупреждающий загрязнение жидкости микробами воздуха во время работы. Пипетки плотно за­вернуть в бумагу, нарезанную полосками шириной 4- 5 см и длиной 50-70 см. Оборачивание начать с носика пипетки. Постепенным движением бумаги вокруг пипет­ки окончить обмотку у конца с ватным тампоном. На бу­маге обязательно указать объем пипеток.

Чашки Петри стерилизовать завернутыми в бумагу по 1-5 шт.

Подготовленную к стерилизации посуду стерилизовать сухим жаром при температуре 160°С в течение 1 ч или влажным жаром в автоклаве при давлении 196 кПа (2 атм) в течение 20—30 мин.

Материалы и оборудование: вата, ножницы, иглы (шприцевые или препаровальные), пипетки градуированные емкостью 1, 2, .5 и 10 мл, чашки Петри, бумага.

3. Ответить на контрольные вопросы.

Контрольные вопросы:1. Что такое стерилизация? Ка­кие агенты могут вызвать гибель микроорганизмов? Какие требова­ния предъявляются к агентам, вызывающим гибель микроорганизмов? 2. Какие вы знаете способы стерилизации под воздействием высоких температур? 3. Что такое автоклавирование? Расскажите о принципе работы автоклава. 4. Какова сущность стерилизации фильтрованием? Для стерилизации каких материалов применяется стерилизация фильт­рованием? 5. В чем сущность стерилизации облучением? Какие ма­териалы можно стерилизовать облучением? Какой механизм действия ультрафиолетовых лучей на микробные клетки? 6. Что такое дезин­фекция? Какие химические соединения применяются для дезинфек­ции?

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: