Сделай Сам Свою Работу на 5

Результаты и их интерпретация,

Для подтверждения заявленной чувствительности LAL-реактива оценивается корректность контроля. Как пример рассмотрим данные с использованием LAL-реактива Pyrotell с заявленной чувствительностью 0,25 ЕДэ/мл. Ниже приведены приготовленью стандартные разведения эндотоксина и полученные результаты.

 

Концентрация эндотоксина 0,5 ЕДэ/мл (2) l 0,25 ЕДэ/мл (1) l 0,125 ЕДэ/мл (0,5) l 0,06 ЕДэ/мл (0,25) l LAL-вода (отрицательный контроль)   Результаты теста + + - - - -

 

Несовпадения результатов Вашего теста с данными, приведенными в таблице, могут свидетельствовать о:

а) нарушении правил инкубирования (например, слишком высокая температура, возможно кратковременное ее повышение, менее вероятны слишком низкая температура и неравномерный нагрев);

б) вибрации во время инкубирования (например, включенная мешалка

для принудительной циркуляции воды в бане, вибрация, передаваемая из других

источников);

в) недостаточном разведении эндотоксина, что возможно при его слабом перемешивании;

г) некачественном LAL-реактиве (истек срок хранения препарата или он хранился в условиях, не соответствующих требованиям, и т.д.).

Положительный результат в отрицательном контроле аннулирует результаты теста. В этом случае рассматривать результаты не имеет смысла, а причиной неудачи является внесение эндотоксина в процессе проведения теста, например:

а) использование неапирогенных пипеток, пробирок. Соблюдение всех условий депирогенизации тем важнее, чем выше чувствительность LAL-реактива. К пипеткам, даже к стеклянным, нужно относиться как к одноразовым в буквальном смысле слова, использовать только один раз для отбора пробы или воды;

б) возможное попадание эндотоксина из воздуха в незакрытые флаконы или пробирки

в) использование "грязной" воды для разведения LAL-реактива, в этом случае подобные результаты будут повторяться, и, возможно, единственным выходом будет использование нового флакона LAL-реактива.

 

В том случае, если в фармакопейной статье не указана максимально допустимая



концентрация эндотоксинов, она может быть вычислена с использованием значения допустимой нормы введения эндотоксина.

Допустимая норма введения эндотоксина должна быть приведена в Фармакопее и указывает на то, сколько единиц эндотоксина можно вводить пациенту на 1 кг массы тела в час. Значение этой нормы зависит от способа введения препарата. Так, в Американской Фармакопее установлено, то интратекальное введение допускает 5 единиц эндотоксина на 1 кг массы тела в час. Для лекарств, вводимых в оболочку спинного мозга, или предназначенных для внутриполостного введения (в головной мозг или оболочку головного мозга), допустимая норма введения эндотоксина составляет 0,2 единицы эндотоксина на 1 кг массы тела.

Таким образом, если для препарата значение допустимой концентрации эндотоксина в частной фармакопейной статье не установлено, оно может быть определено по формуле:

  Максимально допустимая концентрация эндотоксина = К  
М

где К - допустимая норма введения эндотоксина, указанная в Фармакопее;

М - доза препарата, вводимая в течение 1 часа на 1 кг массы тела. Это может быть доза введения препарата, установленная для человека, либо доза, вводимая кроликам. Если значения имеются для обеих доз, всегда используется большее значение.

Грамотрицательные бактерии, эндотоксин, эндотоксемия. Грамотрицательные бактерии (Escherichia Coli, Proteus, Pseudomonas, Enterobacter, Moraxella и др.) часто вызывают тяжёлые инфекционные заболевания, которые могут быть генерализованными (сепсис) или локальными (перитониты, пневмонии, пиелонефриты, флегмоны). По данным Hurley J. (2001) из числа инфекций, которые были зарегистрированы у больных сепсисом, более 50% представляют собой грамотрицательные бактериальные инфекции [1]. Летальность больных грамотрицательным сепсисом в два раза выше, чем грамположительным, в силу патогенных особенностей эндотоксина.

1.1.Эндотоксин (липополисахарид, ЛПС)
Бактериальный эндотоксин является постоянным структурным компонентом наружной клеточной стенки грамотрицательных бактерий. По структуре это липополисахарид. Он состоит из длинной цепи жирной кислоты (липид А), соединённой с сахарной цепью, которые одинаковы у всех грамотрицательных бактерий. К сердцевине сахарной цепи прикреплена вариабельная углеводная цепочка (О-антиген). О-антиген уникален для каждой бактерии и определяет её серотип. Высвобождение эндотоксина происходит при разрушении стенок бактерий. Освобожденный эндотоксин проникает в различные жидкие среды организма (кровь, спинномозговая жидкость, бронхиальная слизь, моча). Но именно возникающая эндотоксемия приводит к различным патофизиологическим эффектам, ухудшающим состояние и, в значительной мере, определяющим тяжесть клинического состояния больного. Его биологическая активность обусловливает тяжёлые осложнения грамотрицательных инфекций.

1.2.Эндотоксемия
Эндотоксемия - циркуляция в крови бактериального эндотоксина в результате разрушения грамотрицательных бактерий. Деградация или гибель бактерий является результатом обширных воспалительных реакций (перитонит, флегмона, септицемия), но может быть вызвана и обычными дозами антибиотиков [2]. Вследствие деградации происходит высвобождение большого количества эндотоксина. Последний связывается с циркулирующими в крови белками к СD14-рецепторам лейкоцитов (особенно моноцитов и макрофагов), эндотелиальными и другими типами клеток. Активированные липополисахарид-связывающим белковым комплексом, мононуклеарные фагоциты продуцируют фактор некроза опухоли, который в свою очередь индуцирует синтез интерлейкина-1. Фактор некроза опухоли и интерлейкин-1 действуют на эндотелиальные клетки, продуцирующие интерлейкин-6, интерлейкин-8 и адгезивные молекулы. Первичное высвобождение эндотоксина приводит к цитокиновому каскаду. Цитокиновый каскад активирует высвобождение провоспалительных цитокинов макрофагов и повышает эндотелиальную адгезию молекул для лейкоцитов, усиливая комплемент-опосредованную реакцию нейтрофилов [3]. Сами макрофаги являются альтернативным источником кислородных радикалов, протеаз, метаболитов арахидоновой кислоты, фактора активации тромбоцитов и цитокинов, усиливающих воспаление. Первичное высвобождение липополисахарида приводит к цитокиновому каскаду, который, вероятно, направлен на усиление местной воспалительной реакции и усиливает клиренс инфекции.

1.3.Эффекты эндотоксемии
Проблема эндотоксемии заключается в способности эндотоксина, в зависимости от концентрации в плазме или от длительности воздействия на клетки тканей, непосредственно активировать клетки сосудистых стенок и лейкоциты, или инициировать каскад цитокиновых медиаторов, определяющих клинический вариант патологического процесса [4-6]. Низкий уровень эндотоксина преимущественно активирует моноциты и макрофаги и соответственно интенсивность фагоцитоза и секреции цитокинов. Он может инициировать альтернативный путь синтеза системы комплемента. Мононуклеарные фагоциты реагируют на эндотоксин продукцией фактора некроза опухоли, который в свою очередь стимулирует синтез интерлейкина-1. Высокие уровни липополисахарида приводят к повреждению эндотелиальных клеток, которое даёт начало коагуляционному каскаду.

При длительном избытке эндотоксина цитокиновый каскад усиливает синтез вторичных эффекторов - оксида азота (NO) и фактора активации тромбоцитов. Эндокринные и паракринные эффекты цитокинов и вторичных медиаторов приводят к системной вазодилатации и гипотензии, снижению сердечной сократимости, гиперактивации системы коагуляции, повреждению и активации эндотелия, системной адгезии лейкоцитов.

Системная вазодилатация и снижение сердечной сократимости имеют следствием снижение перфузии и гипоксию. На этом фоне повреждение эндотелия, прогрессирование активации системы коагуляции и присоединяющееся повышение проницаемости капилляров реализуются в следующие клинические синдромы:
- септический шок;
- полиорганная недостаточность;
- ДВС-синдром;
- респираторный дистресс синдром взрослых.

Перечисленные клинические синдромы могут вызываться различными этиологическими агентами, но именно эндотоксин является одним из наиболее важных, определяя более тяжёлое течение эндотоксемии [1]. Эффективность лечебных вмешательств определяется именно диагностикой самого факта и уровня эндотоксемии.

2. Определение эндотоксемии
Методы количественного определения уровней эндотоксина в плазме больных сепсисом известны более 30 лет [7], и все они основаны на LAL-тесте. Впервые тест был включен в Фармакопею США в 1985 г.

2.1 LAL-тест. Limulus amebocyte lysate (LAL) - это водный лизат из клеток крови (амебоцитов) морского членистоногого, мечехвоста Limulus polyphemus (рис.). Принцип теста заключается в том, что бактериальные эндотоксины плазмы активируют в лизате амебоцитов комплекс ферментов, изменяющий физико-химические свойства смеси. Известны 3 методики реализации теста: гель-тромб тест, турбидиметрический и хромогенный.

2.2 Гель-тромб тест(GLAL) (PyrotellR - Associates of Cape Cod, Inc) - оригинальный полуколичественный метод LAL-теста. Проведение реакции не требует специального оборудования. Методика заключается в добавлении к предварительно растворённому LAL-реактиву исследуемого образца (напр., плазма крови, моча). Далее пробирку помещают на водяную баню и инкубируют 60 мин. при 37°С. Плотный гель на дне пробирки, не разрушающийся при ее переворачивании, называется положительной реакцией и означает, что концентрация эндотоксина в пробе больше или равна чувствительности LAL-реактива. Отсутствие плотного геля или его разрушение при переворачивании пробирки называется отрицательной реакцией и означает, что концентрация эндотоксина в данной пробе слегка или значительно ниже чувствительности LAL-реактива.

2.3 Турбидиметрический LAL-тест(Pyrotell-TR - Associates of Cape Cod, Inc) основан на том, что в присутствии эндотоксина LAL начинает мутнеть. Скорость помутнения прямо пропорциональна количеству эндотоксина в образце. Скорость роста оптической плотности используют для количественного определения эндотоксина. Метод относительно быстрый, специфический, простой в выполнении и экономичный. Чувствительность зависит от протокола выполнения и оборудования. При использовании считывающего устройства LAL-5000 чувствительность составляет от 0,001 ЕДэ/мл.

2.4. Хромогенный LAL-тест(CLAL) (PyrochromeR - Associates of Cape Cod, Inc) основан на добавлении хромогенного вещества, как более чувствительного индикатора эндотоксина, в присутствии LAL. При наличии эндотоксина LAL приобретает жёлтый цвет. Концентрацию эндотоксина определяют по скорости роста оптической плотности. Максимальная чувствительность - 0,005 ЕДэ/мл. Для выполнения исследования необходимо считывающее устройство.

Эндотоксин у больных сепсисом обнаруживается в крови через 60 часов после начала антибиотикотерапии [3]. Возможно его выявление и в других биологических жидкостях (цереброспинальной, моче, др.). Выявляемый здесь эндотоксин интерпретируют как достоверный маркер грамотрицательной инфекции, но не эндотоксемии [8]. Определение уровня эндотоксина в моче, вагинальном секрете, бронхо-альвеолярном лаваже можно использовать как быстрый метод выявления инфекций [9]. В настоящее время LAL-тест широко используют также для тестирования парентеральных фармацевтических препаратов.[1].

Заключение
Клиническое значение LAL-теста заключается в выявлении эндотоксина как надёжного маркера грамотрицательной инфекции. В случае реализации осложнений грамотрицательной инфекции (септический шок, респираторный дистресс синдром взрослых, ДВС-синдром, полиорганная недостаточность) терапия, кроме специальной для этих состояний, должна включать мероприятия, направленные на элиминацию эндотоксина из крови.



©2015- 2017 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.