Подготовка разведении исследуемого препарата.

LAL-тест (гель-тромб тест)

Метод, используемый для определения количества грамотрицательных бактериальных эндотоксинов (липополисахаридов).

Все реактивы, включенные в ЛАЛ-тест набор для гель-тромб теста имеют лицензию FDA и зарегистрированы в Минздраве РФ N99/74.

По этой причине в 1940 году был разработан фармакопейный метод определения пирогенов с использованием подопытных кроликов.

Сорок лет спустя, в 1980 году, в США появилась альтернатива тесту на кроликах — LAL-тест. В 1984 году ссылку на этот тест содержали пять описанных в USP водных препарата, а 23-м издании USP — уже 680 препаратов.

Появлению LAL-теста предшествовала многолетняя работа.

Обнаружив, что введение бактерий (или осколков их клеточных стенок) в кровяное русло краба-мечехвоста вызывает его гибель, американские исследователи Фрэнк Бэнг и Джек Левин со временем выяснили, что эта смерть связана с защитным механизмом реликтового краба. Дело в том, что крабы-мечехвосты уже в течение миллионов лет обитают в придонной части моря с очень высоким содержанием бактерий. Естественно, что в таких условиях любое повреждение покровов краба может повлечь за собой вторжение патогенных микроорганизмов. На этот случай природа наделила амебоциты — единственный тип «кровяных» клеток краба — уникальной способностью: при контакте с бактериями они запускают механизм свертывания гемолимфы. Образовавшийся сгусток закупоривает место повреждения, тем самым предотвращая дальнейшую потерю гемолимфы и защищая животное от заражения.

Позднее это уникальное свойство гемолимфы краба-мечехвоста было использовано при разработке коммерческого реактива для определения пирогенности. По имени реактива, образованного первыми буквами словосочетания «Limulus Amebocite Lisate» получил название и тест на пирогенность.

Получение LAL-реактива — процедура для крабов вполне безопасная: у них берут всего лишь треть (т. е. примерно 200 мл) крови и отпускают в море. Но замена традиционного теста на кроликах на LAL-тест объясняется не только «гуманностью тестирования», но и низкой чувствительностью кролика к пирогенам: если у человека повышение температуры возникает при внутривенном введении 0,3 ЭЕ/кг (по другим данным — 4–8 ЭЕ/кг), то у кролика эта величина составляет 10–15 ЭЕ/кг. Кроме того, определенные группы инъекционных препаратов и технологического оборудования на кроликах испытывать просто невозможно или, по меньшей мере, некорректно. Это:

ненаркотические анальгетики, транквилизаторы, нейролептики, кортикостероиды и некоторые анестетики (т. е. препараты-антипиретики, вызывающие понижение температуры тела, и, следовательно, способные маскировать наличие пирогенов);
препараты плаценты, вакцины, новокаин (т. е. препараты, вызывающие повышение температуры, обусловленное их фармакологическими свойствами);
средства для наркоза, сердечные гликозиды, наркотические анальгетики, инсулин, адреналин, снотворные средства, деполяризующие миорелаксанты (т. е. препараты, которые в силу своих фармакологических свойств вызывают изменения физиологического состояния животных);
инфузионные препараты, суточный объем введения которых превышает 700 мл;
радиофармацевтические препараты;
лекарственное сырье, ампулы, флаконы и все элементы технологического оборудования.

Особенно желательно применение LAL-теста при проверке препаратов антигенной природы и препаратов крови, поскольку их введение ограничивает дальнейшее использование кроликов. В равной степени это относится и к антибиотикам: большие дозы антибиотиков, воздействуя на микрофлору, вызывают у кроликов дисбактериоз или, как в случае линкомицина гидрохлорида — кандидомикоз.

В России действует с января 2001 года ОФС «Бактериальные эндотоксины» (42-000-2-00), разрешающая использование ЛАЛ-теста на территории РФ. Тест признается адекватным пирогенному тесту на кроликах и используется как метод контроля Сертификационными Центрами контроля качества. В настоящее время данный тест активно вводится в частные фармстатьи российскими производителями, среди которых крупнейшие фармпредприятия, такие "Красфарма", "Асфарма", "Ай–Си-Эн Полифарм", "Мосфимфармпрепараты", "Верофар", "Синтез", "Биохимик", "Уфа Вита", "Органика", "Оргсинтез-I" и многие другие.ЛАЛ-тест на сегодняшний день - единственный способ проведения постадийного контроля. Наиболее рациональные точки контроля при изготовлении инъекционных препаратов следующие: контроль сырья; контроль воды для инъекций; проверка элементов фильтра на вымывание из них пирогенов; контроль растворов перед стерилизующим фильтрованием; контроль чистоты ампул, флаконов.

ЛАЛ-тест используется для отработки режимов технологического оборудования, при этом внедрение методики не требует длительного времени и быстро приносит экономический эффект

Впервые этот тест был включен в Фармакопею США XX издания в 1985 г. и получил название "Определение бактериальных эндотоксинов".Впервые ЛАЛ-тест включен в Фармакопею в 1980 г. в США (XX изд.). С 1995 г. в США действует Фармакопея XXIII изд., где есть Статья "Бактериальные эндотоксины". В настоящее время список препаратов, издаваемый FDA, для которых определен допустимый уровень бактериальных эндотоксинов, включает более 660 наименований

В основе теста лежит реакция взаимодействия эндотоксина и лизата амебоцитов Limulus (Limulus Amebocyte Lysate, LAL), полученного из амебоцитов мечехвоста рода Limulus. В ходе реакции эндотоксин вызывает помутнение лизата и образование геля.

LAL-тест дает возможность количественного определения концентрации эндотоксина в испытуемом растворе. Для этого сравнивают реакцию LAL-реактива с раствором, содержащим эндотоксин в неизвестной концентрации, и его реакцию с раствором стандартного препарата эндотоксина в известной концентрации, которая измеряется в единицах эндотоксина на 1 мл (ЕДэ/мл).

Основным предназначением теста является определение количества эндотоксинов в инъекционных препаратах для человека и животных. Он может быть использован для валидации растворов и сырья, используемых в производстве фармпрепаратов, а также для постадийного контроля.

Согласно рекомендации U.S. Food and Drug Administration (FDA) данный метод может использоваться в качестве альтернативного, заменяя тест по определению пирогенности на кроликах.

Описание процедуры LAL-теста

Реактивы.

1. LAL - реактив Pyrotell.

LAL-реактив Pyrotell выпускается компанией Associates of Cape Cod Inc., США в виде лиофилизированного порошка, в состав которого входят: водный экстракт амебоцитов Limulus Polyphemus, 1,5 объемных процента 25%-ного раствора человеческого альбумина (как стабилизатор), 3% NaCL. Порошок расфасован в количествах, позволяющих получить 1, 2 или 5 мл готового жидкого LAL-реактива. Pyrotell выпускается с различной заявленной чувствительностью от 0.03 до 0.5 ЕДэ/мл. Заявленная чувствительность каждого LAL-реактива проверяется по отношению к контрольному стандарту эндотоксина (Control Standard Endotoxin (CSE)), оттитрованному в FDA по Американскому Национальному Стандарту Эндотоксина (Reference Standard Endotoxin (RSE)). Номер лота (партии) LAL-реактива с заявленной чувствительностью указан на этикетке.

Приготовление LAL-реактива

Мягким покачиванием флакона соберите порошок на дне флакона. Удалите вальцовку. Плавно, без резких движений приподнимите пробку, чтобы разрядить вакуум, а затем и вовсе ее удалите. Немедленно после вскрытия закройте флакон кусочком пленки Parafilm (внутренней стороной).

Перед использованием во флакон добавляют 1, 2 или 5 мл апирогенной LAL-воды (входит в комплект), в зависимости от объема используемой фасовки, указанной на этикетке LAL-реактива.

Лиофилизированный LAL-реактив легко растворяется в течение нескольких минут, образуя бесцветный, слегка опалесцирующий раствор. Присутствие в растворе незначительных волокон не является признаком загрязнения раствора и не отражается на его активности. В то же время появление в растворе флуоресцирующего осадка или желтизны, может свидетельствовать о снижении активности реактива.

Перед непосредственным употреблением, медленным покачиванием помешайте раствор для достижения его большей гомогенности. Избегайте вспенивания раствора, которое может привести к снижению его чувствительности.

Условия хранения LAL-реактива:

Лиофилизированный Pyrotell относительно устойчив к высокой температуре и должен храниться при температуре от -20 до +8°С. Pyrotell сохраняет свою активность в течение всего срока, указанного на этикетке.

Хранение при температуре ниже -20°С способствует возникновению трещин на пробке, что может привести к нарушению вакуума во флаконе и загрязнению реактива. Температура свыше 37°С может явиться причиной быстрой денатурации лиофилизированного реактива, что отразится на его чувствительности или вызовет желтое окрашивание.

Pyrotell поставляется в специальной упаковке, позволяющей сохранить заданные температурные условия.

Водный раствор Pyrotell менее устойчив к температуре, чем его лиофилизированная форма. Если растворенный LAL-реактив будет использован в течении 24 часов, то его можно хранить в холодильнике при +2-8°С. В остальных случаях растворенный Pyrotell должен храниться при температуре -20°С не более 3 месяцев. Растворенный Pyrotell может быть заморожен и разморожен только один раз. После оттаивания к раствору LAL-реактива предъявляются те же требования, что и к исходному раствору.

2. Контрольный Стандарт Эндотоксина (Esherichia coli 0113:Н10). Поставляется в высушенном виде. После растворения в 5 мл LAL-воды содержит определенное количество эндотоксина (1000 ЕДэ/мл), оттитрован в FDA по Американскому Национальному Стандарту (RSE) и предназначен для проверки заявленной чувствительности Pyrotell, валидации продукта и приготовления контролей для преодоления ингибирования. В высушенном виде препарат может храниться до 2 лет. Растворенный стандарт хранят в холодильнике при температуре +2-8°С не более 4 недель. Его нельзя замораживать, т.к. это может привести к потере его активности.

3. Апирогенная вода для LAL-теста.

LAL-вода, предназначена для растворения LAL-реактива, приготовления растворов эндотоксина в разных концентрациях, разведения образцов, а также используется в качестве отрицательного контроля необходимо развести исходный препарат равным объемом раствора эндотоксина с концентрацией 4l.

Подготовка разведении исследуемого препарата.

Как правило, для проведения теста используют не исходный препарат, а его разведения. Этому есть несколько объяснений.

1. Высокая чувствительность Pyrotell позволяет определить методом гель-тромб теста концентрацию эндотоксина, равную 0,03-0,06 ЕДэ/мл, что, обычно, значительно ниже допустимой концентрации эндотоксина (для большинства препаратов допустимая концентрация эндотоксинов находится в пределах 0,1-100 ЕДэ/мл).

2. В случаях ингибирования или усиления реакции разведение препарата является самым простым способом устранения этих нежелательных явлений.

3. С помощью серии разведении можно получить не только ответ типа "да/нет", но и достаточно точно оценить концентрацию эндотоксина.

Последовательные разведения препарата готовятся на специальной LAL-воде в специальных пробирках для разведения. При приготовлении разведении надо обратить особое внимание на точность отбора пробы пипеткой. Полученные растворы следует тщательно перемешать. Для отбора каждой пробы необходимо использовать отдельную пипетку.

Поскольку рН реакционной смеси (образец + LАL-реактив) должен находиться в пределах от 6,0 до 8,0, рН образца можно корректировать апирогенными НС1, NaOH или специальным буфером, поставляемым компанией Associates of Cape Cod Inc. He рекомендуется использовать НС1 или NaOH в низких концентрациях, поскольку это может привести к сильному разведению образца.

Проведение реакции.

Все исследуемые образцы должны быть асептически собраны в апирогенную посуду. Необходимо использовать специально рекомендованное для LAL-теста стекло или пластик, чтобы снизить до минимума вероятность адсорбции эндотоксинов поверхностью посуды.

Приготовленные пробы отрицательного контроля, стандартных разведении эндотоксина и разведении препарата вносятся в пробирки для постановки гель-тромб теста по 0,1 мл в каждую. Каждая проба испытывается в двух повторах.

В каждую пробирку добавляют предварительно растворенный LAL-реактив в количестве 0,1 мл, при этом необходимо начинать с отрицательного контроля, затем от более низких концентраций в сторону их увеличения. Для раскапывания LAL-реактива рекомендуется использовать градуированную по 0,1 мл пипетку или автоматическую микропипетку. Для каждого забора Pyrotell из флакона рекомендуется использовать новую пипетку или наконечник.

Получившуюся реакционную смесь (в объеме 0,2 мл) надо аккуратно перемешать в течение 2-3 сек. и пробирку поместить в водяную баню или суховоздушный инкубатор . Необходимо устанавливать пробирки в баню через одинаковые промежутки времени, и в той же последовательности через те же интервалы времени определять результаты теста.. Использовать воду для инъекций или "апирогенную воду" нельзя, так как допустимое содержание эндотоксина в такой воде может быть в несколько раз выше чувствительности используемого LAL-реактива.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: