Изучение строения биомолекул методом хроматографии
Выяснить строение крупных молекул посредством метода дифракции рентгеновских лучей значительно легче, если известны химическая природа субъединиц молекул и хотя бы в общем виде их расположение.
Прогресс в изучении химии белка был достигнут не сразу. Ученые минувшего столетия могли только весьма голословно утверждать, что белковая молекула состоит из аминокислот. На рубеже XX в. немецкому химику Эмилю Фишеру (1852—1919) удалось показать, каким образом аминокислоты комбинируются в молекуле белка. В 1907 г. он даже получил очень простое белковоподобное соединение, состоящее из 18 единиц: 15 молекул одной аминокислоты и 3 молекулы другой.
Какова же структура более сложной белковой молекулы, встречающейся в природе? И в первую очередь, каково точное число каждого типа аминокислот в молекуле белка? Проще всего ответить на этот вопрос, расщепив белковую молекулу на отдельные аминокислоты и на основании химического анализа определив относительное количество каждого компонента.
Однако для современников Фишера этот путь был неприемлем. В те времена обычными химическими методами нельзя было различить аминокислоты, обладавшие сходным строением. Ответ на этот вопрос пришел с появлением нового метода, принцип которого в 1903 г. впервые разработал русский ботаник Михаил Семенович Цвет (1872—1919). Исследуя пигменты растений, Цвет получил сложную смесь, состоящую из столь сходных компонентов, что разделить ее существовавшими химическими методами было почти невозможно. Тогда ученый пропустил раствор смеси по каплям через стеклянную трубку (колонку), заполненную порошком окиси алюминия. Поверхность частиц порошка с разной силой удерживала различные вещества смеси. Когда смесь смывали свежим растворителем, вещества разделялись. Компоненты, наименее прочно связанные с поверхностью порошка, смывались в первую очередь. В конце концов смесь оказывалась разделенной на отдельные пигменты, каждый из которых характеризовался определенной полосой цвета в спектре. Этот метод разделения по цвету получил название хроматографии (от греческих слов chromatos — окраска, цвет и graphein — записывать). К сожалению, работы Цвета прошли незамеченными. Только через полтора десятилетия Вильштеттер, вновь применив метод Цвета, добился его признания. Хроматографию стали широко применять для разделения сложных смесей.
Однако пользоваться колонкой из порошка окиси алюминия для разделения ничтожных количеств смеси было чрезвычайно сложно. Требовался более простой и надежный метод.
Выход был найден лишь в 1944 г., когда английские биохимики Арчер Мартин и Ричард Синдж использовали для метода хроматографии простую фильтровальную бумагу. Опыты проводили так. Каплю смеси аминокислот просушивали близ нижнего края полоски фильтровальной бумаги, а затем опускали его в специальный растворитель. Последний, по закону капиллярности, поднимался по полоске вверх. Проходя через высушенную каплю, растворитель увлекал за собой отдельные аминокислоты со скоростью, характерной для каждой конкретной аминокислоты. В итоге смесь аминокислот оказывалась разделенной. Расположение аминокислот на бумаге выявлялось окрашиванием. Определить количество аминокислоты в каждом пятне не составляло труда.
Новый метод хроматографии на бумаге оказался на редкость эффективным. Он прост и дешев, не требует сложной аппаратуры, позволяет тщательно разделять ничтожные количества компонентов смеси. Метод получил широкое применение во всех областях биохимии. Им, в частности, воспользовался Кальвин в своих экспериментах со смесью молекул из фотосинтезирующих растительных клеток. По существу, исследования без применения метода хроматографии на бумаге стали немыслимы. С его помощью появилась возможность установить точное количество различных аминокислот того или иного белка. Это в свою очередь позволило определить аминокислотный состав одного белка за другим, подобно тому как устанавливают число атомов различных элементов, входящих в то или иное соединение.
Установление первичной структуры белка
Но всего этого оказалось недостаточно. Как известно, химиков интересует не только число атомов в любом соединении, но и их расположение. То же относится и к аминокислотам в молекуле белка. Вопрос о расположении аминокислот сложен. Даже если в молекуле всего несколько десятков аминокислот, число возможных сочетаний астрономически велико, а если их больше 50 (как, например, в гемоглобине, молекула которого имеет среднюю величину), число возможных комбинаций аминокислот выражается числом из 600 знаков. Как же из такого невообразимого числа возможностей правильно выбрать наиболее вероятное расположение аминокислот каждого конкретного белка?
Оказалось, что с помощью метода хроматографии на бумаге эта проблема разрешается очень легко. Однако английскому биохимику Фредерику Сэнгеру понадобилось восемь лет, чтобы исследовать этим методом молекулу инсулина, состоящую всего из 50 аминокислот! Сэнгер расщеплял молекулу на части, методом хроматографии на бумаге разделял короткие цепи и определял слагающие их аминокислоты, а также порядок расположения последних. Это было нелегкой задачей, ибо даже четырехкомпонентный фрагмент может располагаться 24 различными способами. Выявив, каким более коротким цепям дают начало длинные цепи, Сэнгер мало-помалу воссоздал структуру более длинных цепей. К 1953 г. он уже знал точный порядок аминокислот в молекуле инсулина.
Вслед за Сэнгером его методом воспользовался американский биохимик Винсент Виньо. Он применил его к очень простой молекуле окситоцина (гормона задней доли гипофиза), состоящей всего из восьми аминокислот. Установив расположение аминокислот, Виньо попытался синтезировать соединение таким образом, чтобы каждая аминокислота находилась на полагающемся ей месте. Синтез был осуществлен в 1955—1956 гг.; полученный в результате синтетический окситоцин по своим свойствам не уступал природному гормону.
Аналитический метод Сэнгера, равно как и синтез Виньо, впоследствии был повторен в более широком масштабе. В 1960 г. ученые установили расположение аминокислот в ферменте, названном рибонуклеазой. Молекула рибонуклеазы состоит из 124 аминокислот, это в два с половиной раза превышает число аминокислот в молекуле инсулина. Фрагменты рибонуклеазы синтезировали, после чего изучали их ферментативную активность. Таким образом, к 1963 г. удалось установить, что для функционирования молекулы существенно необходимы аминокислоты 12 и 13 (гистидин и метионин). Это было значительным шагом вперед в определении точного механизма функционирования молекулы фермента.
Краткая история генетики
Генетика – наука о наследственности и изменчивости. История этой науки уходит своими корнями в ХIХ век.
Основатель классической генетики – Грегор Иоганн Мендель. Ставил опыты по скрещиванию различных сортов гороха садового . Результаты анализировал с использованием математических методов. 8 февраля и 8 марта 1865 г. он сделал доклад в Брюннском обществе «Опыты над растительными гибридами», издан в 1866 г. Установлена дискретная природа наследственности. Законы Менделя. Их повторное открытие в 1900 г.: работы Гуго де Фриза (Голландия), Карла Корренса (Германия) и Эриха Чермака (Австрия). Менделизм.
Термин генетика –ввелв1906 г. Уильям Бэтсон. От лат. geneticos – относящийся к происхождению или genos – род.
Термины ген, фен, генотип, фенотип – предложил Вильгельм Иогансен (1909 г., Дания).
Хромосомная теория наследственности; её создатели Томас Хант Моргани его ученики: Альфред Стëртевант, Кальвин Бриджес, Герман Мëллер (США; 1910…1930 гг.). Гены расположены линейно на хромосомах, определен их порядок, расстояния между ними. Объект исследований – дрозофила. Морганизм.
1929 г. – Александр Сергеевич Серебровский – сложная организация гена, гипотеза о делимости гена.
1941 г. – Джорж Бидл и Эдвард Тейтум: формула «один ген – один фермент», с последующим уточнением - «один ген – один полипептид».
Идею о том, что хромосома – это гигантская молекула, а гены – ее мономеры, или радикалы впервые высказал Николай Константинович Кольцовв 1928 г. Он же сформулировал матричный принцип воспроизведения хромосом, сохраняющий порядок генов. Однако он ошибочно полагал, что этой молекулой является белок, а не ДНК.
Впервые роль ДНК как носителя наследственной информации показали в 1944 г. О. Эйвери, К. Мак Леод и М. Мак Картипри трансформации пневмококков.
Революция в генетике 50-х гг. в результате синтеза наук (физики, химии, биологии): установление пространственной структуры ДНК («двойная спираль») - Френсис Крик, Джеймс Уотсон, Морис Уилкинс(Нобелевская премия в 1962 г.)
Расшифровка генетического кода в 1961 г. – Р. Холли, Г. Корана, М. Ниренберг(Нобелевская премия в 1968 г.)
Новая революция – в середине 70х - генная инженерия- в результате синтеза различных областей генетики.
Конец 70х гг. – прочтение геномов (геномные проекты). Так, в 1977 г. Ф. Сэнгер разработал метод секвенирования; секвенирована ДНК фага ФХ 174. В том же году Максам и Гилберт предложили другой метод секвенирования.
2003 г. – расшифрован геном человека.
Клонирование животных:в1962 г. Джон Гëрдон пересадил ядро из клетки кишечника головастика лягушки в яйцеклетку лягушки, лишенную ядра – выросла нормальная лягушка.
1997 г. - А. Вилмут (Шотландия) – трансплантация ядер, овечка Долли.
1999 – 2000 гг. – получены клоны мыши, коровы, свиньи.
Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту:
©2015 - 2024 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.
|