Сделай Сам Свою Работу на 5

Изучение строения биомолекул методом хроматографии





Выяснить строение крупных молекул посредством метода дифракции рентгеновских лучей значительно легче, если известны химическая природа субъединиц молекул и хотя бы в общем виде их расположение.

Прогресс в изучении химии белка был достигнут не сразу. Ученые минувшего столетия могли только весьма голословно утверждать, что белковая молекула состоит из аминокислот. На рубеже XX в. немецкому химику
Эмилю Фишеру (1852—1919) уда­лось показать, каким образом аминокислоты ком­бинируются в молекуле белка. В 1907 г. он даже получил очень простое белковоподобное соединение, состоящее из 18 единиц: 15 молекул одной аминоки­слоты и 3 молекулы другой.

Какова же структура более сложной белковой мо­лекулы, встречающейся в природе? И в первую оче­редь, каково точное число каждого типа аминокислот в молекуле белка? Проще всего ответить на этот вопрос, расщепив белковую молекулу на отдельные аминокислоты и на основании химического анализа определив относительное количество каждого компо­нента.

Однако для современников Фишера этот путь был неприемлем. В те времена обычными химическими методами нельзя было различить аминокислоты, обла­давшие сходным строением. Ответ на этот вопрос при­шел с появлением нового метода, принцип которого в 1903 г. впервые разработал русский ботаник Миха­ил Семенович Цвет (1872—1919). Исследуя пигменты растений, Цвет получил сложную смесь, состоящую из столь сходных компонентов, что разделить ее су­ществовавшими химическими методами было почти невозможно. Тогда ученый пропустил раствор смеси по каплям через стеклянную трубку (колонку), запол­ненную порошком окиси алюминия. Поверхность ча­стиц порошка с разной силой удерживала различные вещества смеси. Когда смесь смывали свежим ра­створителем, вещества разделялись. Компоненты, на­именее прочно связанные с поверхностью порошка, смывались в первую очередь. В конце концов смесь оказывалась разделенной на отдельные пигменты, каж­дый из которых характеризовался определенной по­лосой цвета в спектре. Этот метод разделения по цве­ту получил название хроматографии (от греческих слов chromatos — окраска, цвет и graphein — записы­вать). К сожалению, работы Цвета прошли незаме­ченными. Только через полтора десятилетия Вильштеттер, вновь применив метод Цвета, добился его признания. Хроматографию стали широко применять для разделения сложных смесей.





Однако пользоваться колонкой из порошка окиси алюминия для разделения ничтожных количеств сме­си было чрезвычайно сложно. Требовался более про­стой и надежный метод.

Выход был найден лишь в 1944 г., когда англий­ские биохимики
Арчер Мартин и Ричард Синдж использовали для метода хроматогра­фии простую фильтровальную бумагу. Опыты прово­дили так. Каплю смеси аминокислот просушивали близ нижнего края полоски фильтровальной бумаги, а затем опускали его в специальный растворитель. Последний, по закону капиллярности, поднимался по полоске вверх. Проходя через высушенную каплю, растворитель увлекал за собой отдельные аминокис­лоты со скоростью, характерной для каждой конкрет­ной аминокислоты. В итоге смесь аминокислот оказы­валась разделенной. Расположение аминокислот на бумаге выявлялось окрашиванием. Определить количество аминокислоты в каждом пятне не составляло труда.

Новый метод хроматографии на бумаге оказался на редкость эффективным. Он прост и дешев, не тре­бует сложной аппаратуры, позволяет тщательно раз­делять ничтожные количества компонентов смеси. Ме­тод получил широкое применение во всех областях биохимии. Им, в частности, воспользовался Кальвин в своих экспериментах со смесью молекул из фотосинтезирующих растительных клеток. По существу, исследования без применения метода хроматографии на бумаге стали немыслимы. С его помощью появилась возможность установить точное количество различных аминокислот того или иного белка. Это в свою очередь позволило определить аминокислотный состав одного белка за другим, подобно тому как устанавливают число ато­мов различных элементов, входящих в то или иное со­единение.



 

Установление первичной структуры белка

Но всего этого оказалось недостаточно. Как из­вестно, химиков интересует не только число атомов в любом соединении, но и их расположение. То же относится и к аминокислотам в молекуле белка. Во­прос о расположении аминокислот сложен. Даже если в молекуле всего несколько десятков аминокислот, число возможных сочетаний астрономически велико, а если их больше 50 (как, например, в гемоглобине, молекула которого имеет среднюю величину), число возможных комбинаций аминокислот выражается числом из 600 знаков. Как же из такого невообразимого числа возможностей пра­вильно выбрать наиболее вероятное расположение аминокислот каждого конкретного белка?

Оказалось, что с помощью метода хроматографии на бумаге эта проблема разрешается очень легко. Однако английскому биохимику Фредерику Сэнгеру понадобилось восемь лет, чтобы ис­следовать этим методом молекулу инсулина, состоя­щую всего из 50 аминокислот! Сэнгер расщеплял мо­лекулу на части, методом хроматографии на бумаге разделял короткие цепи и определял слагающие их аминокислоты, а также порядок расположения послед­них. Это было нелегкой задачей, ибо даже четырехкомпонентный фрагмент может располагаться 24 раз­личными способами. Выявив, каким более коротким цепям дают начало длинные цепи, Сэнгер мало-по­малу воссоздал структуру более длинных цепей. К 1953 г. он уже знал точный порядок аминокислот в молекуле инсулина.

Вслед за Сэнгером его методом воспользовался американский биохимик Винсент Виньо. Он применил его к очень простой молекуле окситоцина (гормона задней доли гипофиза), состоящей все­го из восьми аминокислот. Установив расположение аминокислот, Виньо попытался синтезировать соеди­нение таким образом, чтобы каждая аминокислота находилась на полагающемся ей месте. Синтез был осуществлен в 1955—1956 гг.; полученный в резуль­тате синтетический окситоцин по своим свойствам не уступал природному гормону.

Аналитический метод Сэнгера, равно как и синтез Виньо, впоследствии был повторен в более широком масштабе. В 1960 г. ученые установили расположение аминокислот в фер­менте, названном рибонуклеазой. Молекула рибонуклеазы состоит из 124 аминокислот, это в два с поло­виной раза превышает число аминокислот в молекуле инсулина. Фрагменты рибонуклеазы синтезировали, после чего изучали их ферментативную активность. Таким образом, к 1963 г. удалось установить, что для функционирования молекулы существенно необхо­димы аминокислоты 12 и 13 (гистидин и метионин). Это было значительным шагом вперед в определении точного механизма функционирования молекулы фер­мента.

 

Краткая история генетики

Генетика – наука о наследственности и изменчивости. История этой науки уходит своими корнями в ХIХ век.

Основатель классической генетики – Грегор Иоганн Мендель. Ставил опыты по скрещиванию различных сортов гороха садового . Результаты анализировал с использованием математических методов. 8 февраля и 8 марта 1865 г. он сделал доклад в Брюннском обществе «Опыты над растительными гибридами», издан в 1866 г. Установлена дискретная природа наследственности. Законы Менделя. Их повторное открытие в 1900 г.: работы Гуго де Фриза (Голландия), Карла Корренса (Германия) и Эриха Чермака (Австрия). Менделизм.

Термин генетикаввелв1906 г. Уильям Бэтсон. От лат. geneticos – относящийся к происхождению или genos – род.

Термины ген, фен, генотип, фенотип – предложил Вильгельм Иогансен (1909 г., Дания).

Хромосомная теория наследственности; её создатели Томас Хант Моргани его ученики: Альфред Стëртевант, Кальвин Бриджес, Герман Мëллер (США; 1910…1930 гг.). Гены расположены линейно на хромосомах, определен их порядок, расстояния между ними. Объект исследований – дрозофила. Морганизм.

1929 г. – Александр Сергеевич Серебровский – сложная организация гена, гипотеза о делимости гена.

1941 г. – Джорж Бидл и Эдвард Тейтум: формула «один ген – один фермент», с последующим уточнением - «один ген – один полипептид».

Идею о том, что хромосома – это гигантская молекула, а гены – ее мономеры, или радикалы впервые высказал Николай Константинович Кольцовв 1928 г. Он же сформулировал матричный принцип воспроизведения хромосом, сохраняющий порядок генов. Однако он ошибочно полагал, что этой молекулой является белок, а не ДНК.

Впервые роль ДНК как носителя наследственной информации показали в 1944 г. О. Эйвери, К. Мак Леод и М. Мак Картипри трансформации пневмококков.

Революция в генетике 50-х гг. в результате синтеза наук (физики, химии, биологии): установление пространственной структуры ДНК («двойная спираль») - Френсис Крик, Джеймс Уотсон, Морис Уилкинс(Нобелевская премия в 1962 г.)

Расшифровка генетического кода в 1961 г. – Р. Холли, Г. Корана, М. Ниренберг(Нобелевская премия в 1968 г.)

Новая революция – в середине 70х - генная инженерия- в результате синтеза различных областей генетики.

Конец 70х гг. – прочтение геномов (геномные проекты). Так, в 1977 г. Ф. Сэнгер разработал метод секвенирования; секвенирована ДНК фага ФХ 174. В том же году Максам и Гилберт предложили другой метод секвенирования.

2003 г. – расшифрован геном человека.

Клонирование животных:в1962 г. Джон Гëрдон пересадил ядро из клетки кишечника головастика лягушки в яйцеклетку лягушки, лишенную ядра – выросла нормальная лягушка.

1997 г. - А. Вилмут (Шотландия) – трансплантация ядер, овечка Долли.

1999 – 2000 гг. – получены клоны мыши, коровы, свиньи.

 








Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту:



©2015 - 2024 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.