Сделай Сам Свою Работу на 5

Глава 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГИСТОЛОГИИ, ЦИТОЛОГИИ И ЭМБРИОЛОГИИ





Для прогресса гистологии, цитологии и эмбриологии большое значение имеет внедрение достижений физики и химии, новых методов смежных наук - биохимии, молекулярной биологии, генной инженерии.

Современные методы исследования не только позволяют изучать ткани как единое целое, но и выделять из них отдельные типы клеток для изучения их жизнедеятельности в течение длительного времени, выделять отдельные клеточные органеллы и составляющие их макромолекулы (например, молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты - ДНК), исследовать их функциональные особенности.

Такие возможности открылись в связи с созданием новых приборов и технологий - различных типов микроскопов, компьютерной техники, рентге-ноструктурного анализа, применения метода ядерно-магнитного резонанса (ЯМР), радиоактивных изотопов и авторадиографии, электрофореза и хроматографии, фракционирования клеточного содержимого с помощью ультрацентрифугирования, разделения и культивирования клеток, получения гибридов; использования биотехнологических методов - получения гибридом и моноклональных антител, рекомбинантных ДНК и др.



Таким образом, биологические объекты можно изучать на тканевом, клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях. Несмотря на внедрение в естественные науки разнообразных биохимических, биофизических, физических и технологических методов, необходимых для решения многих вопросов, связанных с жизнедеятельностью клеток и тканей,гистология в своей основе остается морфологической наукой с присущим ей набором методов. Последние позволяют охарактеризовать процессы, происходящие в клетках и тканях, их структурные особенности.

Главными этапами цитологического и гистологического анализа являются выбор объекта исследования, его подготовка для изучения под микроскопом, качественный и количественный анализ изображений гистологических элементов.

Объектами исследования служат живые и фиксированные клетки и ткани, их изображения, полученные при использовании световых и элек-

тронных микроскопов или на экране дисплея. Существует ряд методов, позволяющих проводить анализ указанных объектов.



2.1. МЕТОДЫ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Основным методом изучения биологических микрообъектов являются световая и электронная микроскопия, которые широко используются в экспериментальной и клинической практике.

Микроскопирование - главный метод изучения микрообъектов, используемый в биологии более 300 лет. Для изучения гистологических препаратов применяют разнообразные виды световых микроскопов и электронные микроскопы. С момента создания и применения первых микроскопов они постоянно совершенствовались. Современные микроскопы представляют собой сложные оптические системы, обладающие высокой разрешающей способностью. Размер самой маленькой структуры, которую можно видеть с помощью микроскопа, определяется наименьшим разрешаемым расстоянием (d), которое в основном зависит от длины волны света (λ) и длины волн электромагнитных колебаний потока электронов и др. Эта зависимость приближенно определяется формулой d = λ/2. Таким образом, чем меньше длина волны, тем меньше разрешаемое расстояние, и тем меньшие по размерам микроструктуры можно видеть в препарате.

Световая микроскопия.Для изучения гистологических микрообъектов применяют обычные световые микроскопы и их разновидности, в которых используются источники света с волнами различной длины. В обычных световых микроскопах источником освещения служит естественный или искусственный свет (рис. 2.1). Минимальная длина волны видимой части спектра примерно 0,4 мкм. Следовательно, для обычного светового микроскопа наименьшее разрешаемое расстояние приблизительно составляет 0,2 мкм, а общее увеличение (произведение увеличения объектива на увеличение окуляра) может быть 1500-2500.



Таким образом, с помощью светового микроскопа можно увидеть не только отдельные клетки размером от 4 до 150 мкм, но и их внутриклеточные структуры - органеллы, включения. Для усиления контрастности микрообъектов применяют их окрашивание.

Ультрафиолетовая микроскопия. Это разновидность световой микроскопии. В ультрафиолетовом микроскопе используют более короткие ультрафиолетовые лучи с длиной волны около 0,2 мкм. Разрешаемое расстояние здесь в 2 раза меньше, чем в обычных световых микроскопах, и составляет приблизительно 0,1 мкм. Полученное в ультрафиолетовых лучах невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь).

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Явления флюоресценции заключаются в том, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротко-

Рис. 2.1.Микроскопы для биологических исследований:

а - световой биологический микроскоп «Биолам-С»: 1 - основание; 2 - ту-бусодержатель; 3 - наклонный тубус; 4 - окуляр; 5 - револьвер; 6 - объективы; 7 - столик; 8 - конденсор с ирисовой диафрагмой; 9 - винт конденсора; 10 - зеркало; 11 - микрометрический винт; 12 - макрометрический винт; б - электронный микроскоп ЭМВ-100АК с автоматизированной системой обработки изображений: 1 - колонка микроскопа (с электронно-оптической системой и камерой для образцов); 2 - пульт управления; 3 - камера с люминесцентным экраном; 4 - блок анализа изображений; 5 - датчик видеосигнала; в - конфокальный микроскоп: 1 - световой микроскоп; 2 - регистратор изображения (фотоэлектронный умножитель);

3 - сканирующее устройство для перемещения светового луча по оси X, Y, Z;

4 - блок питания и стойка управления лазерами; 5 - компьютер для обработки изображений

волновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный переход из возбужденного состояния в нормальное происходит с испусканием света, но с большей длиной волны. В флюоресцентном микроскопе в качестве источников света для возбуждения флюоресценции применяют ртутные или ксе-ноновые лампы сверхвысокого давления, обладающие высокой яркостью в области спектра 0,25-0,4 мкм (ближние ультрафиолетовые лучи) и 0,4-0,5 мкм (сине-фиолетовые лучи). Длина световой волны флюоресценции всегда больше длины волны возбуждающего света, поэтому их разделяют с помощью светофильтров и изучают изображение объекта только в свете флюоресценции. Различают собственную, или первичную, и наведенную, или вторичную, флюоресценцию. Любая клетка живого организма обладает собственной флюоресценцией, однако она часто бывает чрезвычайно слабой.

Первичной флюоресценцией обладают серотонин, катехоламины (адреналин, норадреналин), содержащиеся в нервных, тучных и других клетках, после фиксации тканей в парах формальдегида при 60-80 °С (метод Фалька).

Вторичная флюоресценция возникает при обработке препаратов специальными красителями - флюорохромами.

Существуют различные флюорохромы, которые специфически связываются с определенными макромолекулами (акридиновый оранжевый, родамин, флюоресцеин и др.). Например, при обработке препаратов акридиновым оранжевым ДНК и ее соединения в клетках имеют ярко-зеленое, а РНК и ее производные - ярко-красное свечение. Существует много красителей, с помощью которых можно выявить белки, липиды, внутриклеточные ионы кальция, магния, натрия и др. Таким образом, спектральный состав излучения несет информацию о внутреннем строении объекта и его химическом составе. Вариант метода флюоресцентной микроскопии, при котором и возбуждение, и излучение флюоресценции происходят в ультрафиолетовой области спектра, получил название метода ультрафиолетовой флюоресцентной микроскопии.

Для повышения контрастности флюорохромированных объектов применяется конфокальный вариант оптического микроскопа (см. рис. 2.1, в). В качестве освещения используется пучок монохроматического света малого диаметра, который создает лазерный источник. В каждый момент времени в фокусе микроскопа находится небольшой участок (объем) клетки. Пучок света перемещается по объекту (сканирует объект по осям X, Y, Z). При каждом перемещении пучка света по одной из линий сканирования получается информация об исследуемой структуре, находящейся в данной точке (объеме) по линии сканирования (оптическом срезе клетки), например о локализации белков в составе микротрубочек в клетке. Вся полученная информация от каждой точки сканирования клетки передается на компьютер, объединяется с помощью специальной программы и выдается на экран монитора в виде контрастного изображения. С помощью данного метода микроскопии получается информация о форме клеток, цитоскеле-те, структуре ядра, хромосом и др. С помощью программы компьютер на основе полученной информации по каждой линии сканирования создает объемное изображение клетки, что позволяет рассматривать клетку под разными углами зрения.

Фазово-контрастная микроскопия. Этот метод служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Метод основан на том, что свет, проходя структуры с различным коэффициентом преломления, изменяет свою скорость. Используемая конструкция оптики микроскопа дает возможность преобразовать не воспринимаемые глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменения его амплитуды, т. е. яркости получаемого изображения. Метод фазового контраста обеспечивает контрастность изучаемых неокрашенных структур за счет специальной кольцевой диафрагмы, помещаемой в конденсоре, и так называемой фазовой пластинки, находящейся в объективе. Разновидностью метода фазового контраста является метод фазово-темнопольного контраста, дающий негативное по сравнению с позитивным фазовым контрастом изображение.

Микроскопия в темном поле. В темнопольном микроскопе только свет, который дает дифракцию (огибание волнами) структур в препарате, достигает объектива. Происходит это благодаря наличию в микроскопе специального конденсора, который освещает препарат строго косым светом; лучи от осветителя направляются сбоку. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие частицы в препарате отражают свет, который далее попадает в объектив. В клинике этот метод применяют для изучения кристаллов в моче (мочевая кислота, оксалаты), для демонстрации спирохет, в частностиTreponema pallidum, вызывающей сифилис, и др.

Интерференционная микроскопия. Разновидностями фазово-контрастного микроскопа являются интерференционный микроскоп, который предназначен для количественного определения массы ткани. Дифференциальный интерференционный микроскоп (с оптикой Номарского) используют для изучения рельефа поверхности клеток и других биологических объектов.

В интерференционном микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: один проходит через объект и изменяется по фазе колебания, второй идет, минуя объект. В призмах объектива оба пучка накладываются друг на друга. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. Проведя количественную оценку изменений, определяют концентрацию и массу сухого вещества.

Фазово-контрастный и интерференционный микроскопы позволяют изучать живые клетки. В них используется интерференция, возникающая при комбинации двух наборов волн и создающая изображение микроструктур. Преимуществом фазово-контрастной, интерференционной и темно-польной микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью цейтраферной (покадровой) микровидеосъемки.

Поляризационная микроскопия.Поляризационный микроскоп является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляризационных фильтра: первый (поляризатор) - между пучком света и объектом, а второй (анализатор) - между линзой объектива и глазом. Через первый фильтр свет проходит только в одном направлении, второй фильтр имеет главную ось,

которая располагается перпендикулярно первому фильтру, и он не пропускает свет. Получается эффект темного поля. Структуры, содержащие продольно ориентированные молекулы (коллаген, микротрубочки, микрофиламенты), и кристаллические структуры, обладают свойством вращать ось световых лучей, исходящих из поляризатора. При изменении оси вращения данные структуры проявляются как светящиеся на темном фоне. Способность кристаллов или паракристаллических образований к раздвоению световой волны на обыкновенную и перпендикулярную к ней называется двойным лучепреломлением. Такой способностью обладают фибриллы поперечнополосатых мышц.

Электронная микроскопия.Большим шагом вперед в развитии техники микроскопии было создание и применение электронного микроскопа (см. рис. 2.1). В электронном микроскопе используется поток электронов с волнами более короткими, чем в световом микроскопе. При напряжении 50 000 В длина волны электромагнитных колебаний, возникающих при движении потока электронов в вакууме, равна 0,0056 нм. Теоретически рассчитано, что разрешаемое расстояние в этих условиях может быть около 0,002 нм, или 0,000002 мкм, т. е. в 100 000 раз меньше, чем в световом микроскопе. Практически в современных электронных микроскопах разрешаемое расстояние составляет около 0,1-0,7 нм.

В гистологии используются трансмиссионные (просвечивающие) электронные микроскопы (ТЭМ), сканирующие (растровые) электронные микроскопы (СЭМ) и их модификации. С помощью ТЭМ можно получить лишь плоскостное изображение изучаемого микрообъекта. Для получения пространственного представления о структурах применяют СЭМ, способные создавать трехмерное изображение. Растровый электронный микроскоп работает по принципу сканирования электронным микрозондом исследуемого объекта, т. е. последовательно «ощупывает» остро сфокусированным электронным пучком отдельные точки поверхности. Такое исследование объекта называется сканированием(считыванием), а рисунок, по которому движется микрозонд, - растром. Полученное изображение выводится на телевизионный экран, электронный луч которого движется синхронно с микрозондом.

Главными достоинствами растровой электронной микроскопии являются большая глубина резкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от десятков до десятков тысяч раз) и высокая разрешающая способность. Современными вариантами приборов для изучения поверхности объекта является атомно-силовой микроскоп и сканирующий туннельный микроскоп.

Электронная микроскопия с использованием метода замораживания - скалывания применяется для изучения деталей строения мембран и межклеточных соединений. Для изготовления сколов клетки замораживают при низкой температуре (-160 °С). При исследовании мембраны плоскость скола проходит через середину бислоя липидов. Далее на внутренние поверхности полученных половинок мембран напыляют металлы (платина, палладий, уран), изучают их с помощью ТЭМ и микрофотографии.

Метод криоэлектронной микроскопии. Быстро замороженный тонкий слой (около 100 нм) образца ткани помещают на микроскопическую решетку и исследуют в вакууме микроскопа при -160 °С.

Метод электронной микроскопии «замораживание - травление» применяют для изучения внешней поверхности мембран клеток. После быстрого замораживания клеток при очень низкой температуре блок раскалывают лезвием ножа. Образующиеся кристаллы льда удаляют путем возгонки воды в вакууме. Затем участки клеток оттеняют, напыляя тонкую пленку тяжелого металла (например, платины). Метод позволяет выявлять трехмерную организацию структур.

Таким образом, методы замораживания - скалывания и замораживания - травления позволяют изучать нефиксированные клетки без образования в них артефактов, вызываемых фиксацией.

Методы контрастирования солями тяжелых металлов позволяют исследовать в электронном микроскопе отдельные макромолекулы - ДНК, крупных белков (например, миозин). При негативном контрастировании изучают агрегаты макромолекул (рибосомы, вирусы) либо белковые филаменты (актиновые нити).

Электронная микроскопия ультратонких срезов, полученных методом криоультрамикро-томии. При этом методе кусочки тканей без фиксации и заливки в твердые среды быстро охлаждают в жидком азоте при температуре -196 °С. Это обеспечивает торможение метаболических процессов клеток и переход воды из жидкой фазы в твердую. Далее блоки режут на ультрамикротоме при низкой температуре. Такой метод приготовления срезов обычно используют для определения активности ферментов, а также для проведения иммунохимических реакций. Для выявления антигенов применяют антитела, связанные с частицами коллоидного золота, локализацию которого легко выявить на препаратах.

Методы сверхвысоковольтной микроскопии. Используют электронные микроскопы с ускоряющим напряжением до 3 000 000 В. Преимущество этих микроскопов в том, что они позволяют исследовать объекты большой толщины (1-10 мкм), так как при высокой энергии электронов они меньше поглощаются объектом. Стереоскопическая съемка позволяет получать информацию о трехмерной организации внутриклеточных структур с высоким разрешением (около 0,5 нм).

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ФИКСИРОВАННЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

Основным объектом исследования являются гистологические препараты, приготовленные из фиксированных тканей и органов. Препарат может представлять собой мазок (например, мазок крови, костного мозга, слюны, цереброспинальной жидкости и др.), отпечаток (например, селезенки, тимуса, печени), пленку из ткани (например, брюшины, плевры, мягкой оболочки мозга), тонкий срез. Гистологические препараты могут изучаться без специальной обработки, например с применением фазово-контрастного микроскопа. Наиболее часто для световой микроскопии используются срезы ткани или органа с последующей их окраской.

Процесс изготовления гистологического препарата для световой и электронной микроскопии включает следующие основные этапы: 1) взятие материала и его фиксация; 2) уплотнение материала; 3) приготовление срезов; 4) окрашивание или контрастирование срезов. Для световой микроскопии необходим еще один этап - заключение срезов в бальзам или другие

прозрачные среды (5). Фиксация обеспечивает предотвращение процессов разложения, что способствует сохранению целостности структур. Это достигается тем, что взятый из органа маленький образец либо погружают в фиксатор (спирт, формалин, растворы солей тяжелых металлов, осмиевая кислота, специальные фиксирующие смеси), либо подвергают термической обработке. Под действием фиксатора в тканях и органах происходит необратимая коагуляция белков, вследствие которой жизнедеятельность прекращается, а структуры становятся мертвыми, фиксированными.

Уплотнение кусочков, необходимое для приготовления срезов, производится путем обезвоживания спиртами возрастающей концентрации и пропитывания парафином, целлоидином, органическими смолами. Более быстрое уплотнение достигается применением метода замораживания кусочков, например в жидкой углекислоте.

Приготовление срезов производится с помощью специальных приборов - микротомов и замораживающих микротомов, или криостатов (для световой микроскопии) и ультрамикротомов (для электронной микроскопии). Толщина среза для светооптического исследования колеблется от 5 до 20 мкм, а для электронной микроскопии - от 40 до 100 нм. Для сравнения 1 мм равен 1000 мкм и 1 000 000 нм.

Окрашивание срезов (для световой микроскопии) или напыление их солями металлов (для электронной микроскопии) применяют для увеличения контрастности изображения отдельных структур. Методы окраски гистологических структур очень разнообразны и выбираются в зависимости от задач исследования. Гистологические красители подразделяют на кислые, основные и нейтральные. В качестве примера можно привести наиболее известный основной краситель гематоксилин, который окрашивает ядра в фиолетовый цвет, и кислый краситель - эозин, окрашивающий цитоплазму в розово-оранжевый цвет. Избирательное сродство структур к определенным красителям обусловлено их химическим составом и физическими свойствами. Структуры, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называютсяоксифильными (ацидофильными, эозинофильными), а окрашивающиеся основными - базофильными. Структуры, воспринимающие как кислые, так и основные красители, являются нейтрофильными (гетерофильными). Существуют структуры клетки, которые окрашиваются в цвет, отличный от цвета используемого красителя. Это явление называетсяметахромазия. Окрашенные препараты обычно обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и просветляют в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах. Для длительного сохранения обезвоженный гистологический срез заключают между предметным и покровным стеклами в канадский бальзам или другие вещества. Готовый гистологический препарат может быть использован для изучения под микроскопом в течение многих лет. Для электронной микроскопии срезы, полученные с помощью ультрамикротома, помещают на специальные сетки, контрастируют солями свинца, кобальта, после чего просматривают в микроскопе и фотографируют. Полученные микрофотографии служат объектом изучения наряду с гистологическими препаратами.

2.3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖИВЫХ КЛЕТОК

И ТКАНЕЙ

Изучение живых клеток и тканей позволяет получить наиболее полную информацию об их жизнедеятельности - проследить движение, процессы деления, разрушения, роста, дифференцировки и взаимодействия клеток, продолжительность их жизненного цикла, реактивные изменения в ответ на действие различных факторов.

Прижизненные исследования клеток в организме (in vivo). Одним из прижизненных методов исследования является наблюдение структур в живом организме. С помощью специальных просвечивающих микроскопов-иллюминаторов, например, можно изучать в динамике циркуляцию крови в микрососудах. После проведения анестезии у животного объект исследования (например, брыжейка кишки) выводят наружу и рассматривают с помощью микроскопа, при этом ткани должны постоянно увлажняться изотоническим раствором натрия хлорида. Однако длительность такого наблюдения ограничена. Лучшие результаты дает метод вживления прозрачных камер в организм животного.

Наиболее удобным органом для вживления таких камер и последующего наблюдения является ухо какого-либо животного (например, кролика). Участок уха с прозрачной камерой помещают на предметный столик микроскопа и в этих условиях изучают динамику изменения клеток и тканей в течение продолжительного времени. Так могут изучаться процессы выселения лейкоцитов из кровеносных сосудов, различные стадии образования соединительной ткани, капилляров, нервов и другие процессы. В качестве естественной прозрачной камеры можно использовать глаз экспериментальных животных. Клетки, ткани или образцы органов помещают в жидкость передней камеры глаза в угол, образованный роговицей и радужкой, и наблюдение ведут через прозрачную роговицу. Таким образом была проведена трансплантация оплодотворенной яйцеклетки и прослежены ранние стадии развития зародыша. Обезьянам были пересажены небольшие кусочки матки и изучены изменения ее слизистой оболочки в различные фазы менструального цикла.

Широкое применение нашел метод трансплантации клеток крови и костного мозга от здоровых животных-доноров животным-реципиентам, подвергнутым смертельному облучению. Животные-реципиенты после трансплантации оставались живыми вследствие приживления донорских клеток, образующих в селезенке колонии кроветворных клеток. Исследование числа колоний и их клеточного состава позволяет выявлять количество родоначальных кроветворных клеток и различные стадии их дифференцировки. С помощью метода колониеобразования установлены источники развития всех клеток крови.

Витальное и суправитальное окрашивание.При витальном (прижизненном) окрашивании клеток и тканей краситель вводят в организм животного, при этом он избирательно окрашивает определенные клетки, их органеллы или межклеточное вещество. Например, с помощью трипанового синего или литиевого кармина выявляют фагоциты, а с помощью ализарина - новообразованный матрикс кости.

Суправитальным окрашиванием называют окрашивание живых клеток, выделенных из организма. Таким способом выявляют молодые формы эритроцитов - ретикулоциты крови (краситель бриллиантовый крезиловый голубой), митохондрии в клетках (краситель зеленый янус), лизосомы (краситель нейтральный красный).

Исследования живых клеток и тканей в культуре (in vitro). Этот метод является одним из самых распространенных. Выделенные из организма человека или животных клетки, маленькие образцы тканей или органов помещают в стеклянные или пластмассовые сосуды, содержащие специальную питательную среду - плазму крови, эмбриональный экстракт, а также искусственные среды.

Различают суспензионные культуры (клетки взвешены в среде), тканевые, органные и монослойные культуры (эксплантированные клетки образуют на стекле сплошной слой). Обеспечиваются стерильность среды и температура, соответствующая температуре тела. В этих условиях клетки в течение длительного времени сохраняют основные показатели жизнедеятельности - способность к росту, размножению, дифференцировке, движению. Такие культуры могут существовать многие дни, месяцы и даже годы, если обновлять среду культивирования и пересаживать жизнеспособные клетки в другие сосуды. Некоторые виды клеток благодаря изменениям в их геноме могут сохраняться и размножаться в культуре, образуя непрерывные клеточные линии. В разработку методов культивирования клеток и тканей большой вклад внесли А. А. Максимов, А. В. Румянцев, Н. Г. Хлопин, А. Д. Тимофеевский, Ф. М. Лазаренко. В настоящее время получены клеточные линии фибробластов, миоцитов, эпителиоцитов, макрофагов, которые существуют многие годы.

Использование метода культивирования позволило выявить ряд закономерностей дифференцировки, злокачественного перерождения клеток, взаимодействий клеток с вирусами и микробами. Особую значимость метод культивирования тканей имеет для проведения экспериментальных наблюдений. Взятые из организма человека клетки при пункции или биопсии могут в культуре тканей использоваться для определения пола, наследственных заболеваний, злокачественного перерождения, выявления действия ряда токсичных веществ.

Клеточные культуры широко применяются для гибридизации клеток.

Разработаны методы разделения тканей на клетки, выделение отдельных типов клеток и их культивирования. Вначале ткань превращают в суспензию клеток путем разрушения межклеточных контактов и внеклеточного матрикса с помощью протеолитических ферментов (трипсин, коллагеназа) и соединений, связывающих Са2+ (с помощью ЭДТА - этилендиаминтетраацетата). Далее полученную суспензию разделяют на фракции клеток различных типов с помощью центрифугирования, позволяющего отделить более тяжелые клетки от легких, большие от малых, или путем прилипания клеток к стеклу или пластмассе, способность к которому у различных типов клеток неодинакова. Для обеспечения специфического прилипания клеток к поверхности стекла используют антитела, специфически связывающиеся с клетками одного типа. Прилипшие клетки затем отделяют, разрушая

матрикс ферментами, при этом получают взвесь однородных клеток. Более тонким методом разделения клеток является мечение антителами, связанными с флюоресцирующими красителями. Меченые клетки отделяются от немеченых с помощью сортера (электронного флюоресцентно-активируемого клеточного анализатора). Клеточный анализатор сортирует в 1 секунду около 5000 клеток. Выделенные клетки можно изучать в условиях культивирования.

Метод культивирования клеток позволяет изучать их жизнедеятельность, размножение, дифференцировку, взаимодействие с другими клетками и др.

Культуры обычно готовят из суспензии клеток, полученной вышеописанным методом диссоциации ткани. Большинство клеток не способны расти в суспензии, им необходима твердая поверхность, в качестве которой используют поверхность пластиковой культуральной чашки, иногда с компонентами внеклеточного матрикса, например коллагена. Первичными культурами называют культуры, приготовленные непосредственно после первого этапа фракционирования клеток, вторичными - культуры клеток, пересаженные из первичных культур в новую среду. Можно последовательно перевивать клетки в течение недель и месяцев, при этом клетки сохраняют характерные для них гистогенетические признаки (например, клетки эпителия образуют пласты). Исходным материалом для клеточных культур обычно служат эмбриональные ткани и ткани новорожденных.

В качестве питательных сред используют смеси солей, аминокислот, витаминов, сыворотки крови, экстракт куриных эмбрионов, эмбриональную сыворотку и др. В настоящее время разработаны специальные среды для культивирования различных типов клеток. Они содержат один или несколько белковых факторов роста, необходимых клеткам для жизнедеятельности и размножения. Например, для роста нервных клеток необходим фактор роста нервов.

У большинства клеток в культуре наблюдается определенное число делений (50-100), а затем они погибают. Иногда в культуре появляются мутантные клетки, которые размножаются бесконечно и образуют клеточную линию (фибробла-сты, эпителиоциты, миобласты и др.). Мутантные клетки отличаются от раковых клеток, также способных к непрерывному делению, но клетки растут без прикрепления к твердой поверхности. Раковые клетки в культуральных чашках образуют более плотную популяцию, чем популяции обычных клеток. Аналогичное свойство можно вызвать экспериментально у нормальных клеток путем трансформации их опухолеродными вирусами или химическими соединениями, при этом образуются неопластически трансформированные клеточные линии. Клеточные линии нетрансформированных и трансформированных клеток можно длительно сохранять при низких температурах (-70 °С). Генетическую однородность клеток усиливают клонированием, когда из одной клетки при ее последовательном делении получают большую колонию однородных клеток. Клон - это популяция клеток, происходящих из одной клетки-предшественника.

Клеточные гибриды.При слиянии двух клеток различных типов образуется гетерокарион - клетка с двумя ядрами. Для получения гетерокариона суспензию клеток обрабатывают полиэтиленгликолем или инактивирован-ными вирусами для повреждения плазмолемм клеток, после чего клетки способны к слиянию. Например, неактивное ядро эритроцита курицы становится активным (синтез РНК, репликация ДНК) при слиянии клеток и переносе в цитоплазму другой клетки, растущей в культуре ткани. Гетерокарион способен к митозу, в результате чего образуется гибридная

клетка. Оболочки ядер у гетерокариона разрушаются, и их хромосомы объединяются в одном большом ядре.

Клонирование гибридных клеток приводит к образованию гибридных клеточных линий, которые используются для изучения генома. Например, в гибридной клеточной линии «мышь-человек» установлена роль хромосомы 11 человека в синтезе инсулина.

Гибридомы.Клеточные линии гибридом используют для получения моно-клональных антител. Антитела вырабатываются плазмоцитами, которые образуются из В-лимфоцитов при иммунизации. Определенный вид антител получают при иммунизации мышей конкретными антигенами. Если клонировать такие иммунизированные лимфоциты, то можно получить большое количество однородных антител. Однако время жизни В-лимфоцитов в культуре ограничено. Поэтому производят их слияние с «бессмертными» опухолевыми клетками (В-лимфомы). В результате образуются гибридомы (гибрид-клетка с геномом от двух разных клеток; ома - окончание в названиях опухолей). Такие гибридомы способны размножаться длительно в культуре и синтезировать антитела определенного вида. Каждый клон гибридомы является источником моноклональных антител. Все молекулы антител данного вида обладают одинаковой специфичностью связывания антигенов. Можно получать моноклональные антитела против любого белка, содержащегося в клетке, и использовать их для установления локализации белков в клетке, а также для выделения белка из смеси (очистка белков), что позволяет исследовать структуру и функцию белков. Моноклональные антитела применяют также в технологии клонирования генов.

Антитела можно использовать для изучения функции различных молекул, вводя их через плазмолемму непосредственно в цитоплазму клеток тонкой стеклянной пипеткой. Например, введение антител к миозину в цитоплазму оплодотворенной яйцеклетки морского ежа останавливает разделение цитоплазмы.

Технология рекомбинантных ДНК.Классические генетические методы позволяют изучать функцию генов, анализируя фенотипы мутантных организмов и их потомства. Технология рекомбинантных ДНК дополняет эти методы, позволяет проводить детальный химический анализ генетического материала и получать в больших количествах клеточные белки.

Методы гибридизации широко используют в современной биологии для изучения структуры генов и их экспрессии.

2.4 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И МЕТАБОЛИЗМА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

Для изучения химического состава биологических структур - локализации веществ, их концентрации и динамики в процессах метаболизма применяют специальные методы исследования.

Цито- и гистохимические методы.Эти методы позволяют выявлять локализацию различных химических веществ в структурах клеток, тканей и орга-

нов - ДНК, РНК, белков, углеводов, липидов, аминокислот, минеральных веществ, витаминов, активность ферментов. Эти методы основаны на специфичности реакции между химическим реактивом и субстратом, входящим в состав клеточных и тканевых структур, и окрашивании продуктов химических реакций. Для контроля специфичности реакции часто применяют соответствующие ферменты. Например, для выявления в клетках рибонуклеиновой кислоты (РНК) часто используют галлоцианин - краситель с основными свойствами, а наличие РНК подтверждают контрольной обработкой рибонуклеазой, расщепляющей РНК. Галлоцианин окрашивает РНК в сине-фиолетовый цвет. Если срез предварительно обработать рибонуклеазой, а затем окрасить галлоцианином, то отсутствие окрашивания подтверждает наличие в структуре рибонуклеиновой кислоты. Описание многочисленных цито- и гистохимических методов дается в специальных руководствах.

Сочетание гистохимических методов с методом электронной микроскопии привело к развитию нового перспективного направления - электронной гистохимии. Этот метод позволяет изучать локализацию различных химических веществ не только на клеточном, но и на субклеточном и молекулярном уровнях. Для изучения макромолекул клеток используют очень чувствительные методы с применением радиоактивных изотопов и антител, позволяющие обнаружить даже небольшое содержание молекул (менее

1000).

Радиоактивные изотопы при распаде ядра испускают заряженные частицы (электроны) или излучение (например, гамма-лучи), которые можно зарегистрировать специальными приборами. Радиоактивные изотопы используют в методе радиоавтографии. Например, с помощью радиоизотопов 3Н-тимидина исследуют ДНК ядра, с помощью 3Н-уридина - РНК.

 








Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту:



©2015 - 2024 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.