УФ СПЕКТРЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Интенсивное поглощение всех нуклеиновых кислот в ближней УФ-области почти целиком обязано пуриновым и пиримидиновым основаниям. Сахарофосфатный остов РНК и ДНК дает незначительный вклад в спектр поглощения при длинах волн, превышающих 200 нм.

Спектры рибонуклеотидов весьма близки к ним, за исключением спектра уридина (U), у которого λ_mах = 260, а не 268 нм.

Однако электронная структура пуринов и пиримидинов гораздо сложнее, чем белковых хромофорных групп. Основания имеют очень низкую симметрию и много несвязывающих электронов. Сопоставление со спектрами ряда более простых молекул показывает, что у всех оснований в области от 200 до 300 нм должно проявляться несколько разных n → π*- и π → π*-переходов. Кажущиеся простыми полосы поглощения аденина (A) и урацила (U) с λ_max = 260 нм, имеющие вид гауссовых кривых, в действительности порождаются более чем одним переходом. G и С имеют по две полосы. На самом деле они, вероятно, обладают большим числом неразрешенных полос.

Свободное основание, нуклеозид (основание, присоединенное к сахару), нуклеотид (основание, присоединенное к фосфату сахара) и денатурированный полинуклеотид все они имеют очень похожие спектры поглощения в этой области (см. табл. 2.3.2).

Таблица 2.3.2

Полосы поглощения нуклеотидов

Спектры всех четырех нуклеозидов чувствительны к рН. Протонирование С и G приводит к значительному сдвигу поглощения в сторону больших длин волн (красное смещение). Депротонирование U или Т при щелочных рН также приводит к существенному красному смещению максимума поглощения. Протонирование А сопровождается гораздо меньшими спектральными изменениями. Все эти эффекты весьма полезны для определения степени ионизации отдельных составляющих нуклеиновых кислот, однако в полимерах они становятся более сложными из-за сильного электронного взаимодействия между основаниями. Присутствие фосфатных групп, по-видимому, не сказывается сколько-нибудь заметно на молярной экстинкции различных составляющих нуклеиновых кислот.

Энергия длинноволновых, достаточно интенсивных электронных переходов пяти наиболее распространенных оснований почти одинакова. Это служит серьезным препятствием для детального анализа электронных спектров ДНК и РНК. Полосы поглощения отдельных хромофоров типичной нуклеиновой кислоты сливаются и дают простую на вид полосу с λ_max = 260 нм (см. рис. 2.3.8).

Рис.2.3.8 Спектр поглощения ДНК как функция температуры.

После расщепления ДНК ферментами в растворе должны присутствовать только мононуклеотиды и, возможно, небольшое количество коротких олигомеров. Спектр, измеренный при высокой температуре, очень близок к спектру препарата, обработанного ферментами. I - нативная ДНК, 25⁰С; II - препарат, обработанный ферментами; III - ДНК Rcoli, 82^oС. [D.Voet, W.B.Gratzer, R.A.Cox, P.Doty, Biopolymers, 1, 193 (1963).]

Свойства отдельных оснований оказываются весьма близкими, так что даже в отсутствие достаточно сильного взаимодействия между основаниями трудно представить полосу поглощения с λ_max = 260 нм для нуклеиновой кислоты в виде суммы четырех составляющих с определенными весами.

Средний коэффициент молярной экстинкции при 260 нм в расчете на моль нуклеозидов равен примерно 1,0·10⁴.

В общем, поленуклеотиды и нуклеиновые кислоты поглощают меньше в расчете на нуклеотид, чем сумма составляющих их нуклеотидов. Таким образом, природная двухспиральная ДНК поглощает меньше на нуклеотид, чем денатурированная («расплавленная») нить ДНК, т.е. и здесь, как и в белках, наблюдается гипохромизм.

Рис.2.3.9 Гиперхромный эффект при денатурации нуклеиновых кислот.

Гипо- и гиперхромизм полинуклеотидов или нуклеиновых кислот относительно нуклеотидов в первую очередь является следствием взаимодействий между соседними основаниями при их упорядоченном размещении в спиральном полимере. Изменения при денатурации в одиночных спиралях или при гидролизе мононуклеотидов легко измеряются (обычно они составляют 30 - 40%) и часто используются для наблюдения за кинетикой или термодинамикой процесса денатурации НК или определения температуры плавления вторичной структуры (см. рис. 2.3.10).

Рис.2.3.10 Определение температуры плавления вторичной структуры ДНК
методом электронной спектроскопии, основанном на гиперхромном эффекте.

Гипохромность полинуклеотидов или нуклеиновых кислот относительно мономерных нуклеотидов является следствием взаимодействий между соседними основаниями при их упорядоченном расположении в спиральной цепи полимера. Происхождение гипохромизма по своей природе электромагнитно. Оно включает взаимодействия между переходными дипольными моментами индивидуальных оснований и их соседей. Таким образом, оно зависит не только от внутренних переходных моментов каждого основания, которые для химически различных оснований отличаются по величине и направлению, но также от относительной ориентации взаимодействующих оснований. Упорядоченные основания поглощает слабее в расчете на нуклеотид, чем неупорядоченные. Стопка из двух оснований имеет немного меньшую оптическую плотность, чем удвоенная оптическая плотность одного основания; и так далее. Таким образом, пары контактирующих оснований в двойной спирали поглощают меньше, чем частично контактирующие основания в одиночной спирали, которые поглощают слабее, чем мононуклеотиды.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: