Тиамин (В1) 0.5 Цитокинин (6-БАП) 0.5

Пиридоксин (В6) 0.5 Агар-агар 7000

Для культивирования меристем смородины, малины и других ягодных культур применяются аналогичные среды, но на основе неразбавленной среды МС. В результате проведенных ранее исследований, для культивирования меристем малины нами предложены среды, содержащие вместо 6-БАП по 0.05-0.2 мг\л цитокининов ряда дифенилмочевины, например тидиазурона или пиридилфенилмочевины. Эти среды дают гораздо лучшие результаты, особенно для генотипов, меристемы которых

полностью погибают на стандартных средах.

Цель работы: Практическое ознакомление студентов с методикой вычленения точек роста земляники, как важнейшим этапом начала клонального микроразмножения растений.

Материалы: Автоклавированные среды для культивирования меристем, 0.1% раствор сулемы, стерильные кружки фильтровальной бумаги, стерильная дистиллированная вода, спирт для стерилизации инструментов и горения спиртовки, растительный материал для выделения меристем.

Оборудование: Стереомикроскоп с максимальным увеличением не менее 28 (МБС-10) - 2-3 шт, стерильные пробирки, стерильный стаканчик на 100 мл с делениями, электроплитка, спиртовка, стаканчик на 50-100 мл для стерилизации инструмента, стаканчик на 100-150 мл, глазные пинцеты – 4 шт, скальпели – 4 шт, торцевые ножи - 2шт, препаравальные иглы – 2 шт.

Ход работы:

1. Разлить по пробиркам предварительно расплавленную на электроплитке питательную среду для культивирования меристем.

2. Розетки земляники отмыть в воде; с них обрезать все корни и листья с частью прилистников. Побеги со спящими почками розы, смородины, вишни и других древесных культур нарезать на черенки длиной 3 - 5 см, а с почек удалить самые верхние чешуйки.

3.Подготовленный растительный материал стерилизовать 0.1% раствором сулемы в течении 5 мин и затем промыть 4 - 6 раз стерильной дистиллированной водой и обсушить стерильной фильтровальной бумагой.

4. Под стереомикроскопом последовательно удалить с розеток земляники зачатки листьев и прилистники сначала при увеличении 14, а затем 28. Препаровальной иглой,

заточенной как торцевой нож, подрезать меристематический купол и перенести на питательную среду. На почках древесных культур сделать надрез в виде полукольца, не доходящий до середины почки, на уровне примерно одной трети ее высоты от основания. Откинуть вверх сразу все подрезанные чешуйки и обнажить меристему с листовыми и цветочными зачатками. Произвести выделение меристемы. Изнутри почки являются стерильными, если они не инфицированы патогенными микроорганизмами, и чтобы не занести внутрь инфекцию, помимо поверхностной стерилизации необходимо в ходе удаления чешуй или листовых зачатков несколько раз перестерилизовывать инструменты, обжигая их в пламени спиртовки.

5. Культивировать меристемы до получения побегов. Пронаблюдать и зарисовывать развивающиеся меристемы через 2, 4 и 6 недель.

Контрольные вопросы: 1. Что такое первичный эксплант? 2. Какие типы первичных эксплантов применяются при клональном микроразмножении? 3.Какие преимущества имеет использование меристем? 4. Как добиться стерильности выделенных меристем? 5. Какие фитогормоны используются для культивирования меристем?

Работа 5. Оздоровление растительного материала от вирусной инфекции. Выделение и культивирование in vitro меристем картофеля.

Выделение меристем является одним из ключевых мероприятий для оздоровления растительного материала от вирусной инфекции, при осуществлении которого выделяется пять основных этапов:

1. Отбор исходного растительного материала для

оздоровления. Выделение эксплантов должно проводиться с растений, имеющих выраженные признаки сорта и, по возможности, в меньшей степени зараженных патогенами.

2. Термообработка (термотерапия) растений, их частей или органов, которая позволяет полностью уничтожить некоторые виды вирусов и значительно снизить содержание оставшихся, расширить свободные от вирусов зоны вокруг меристем. Предложены различные режимы термообработки для разных культур и сортов. Длительность термотерапии составляет обычно от 2 недель до нескольких месяцев, при постоянной или периодически повышающейся температуре, лежащей в диапазоне 36⁰- 45⁰.

3. Выделение меристем. Меристемы оказываются свободны от вирусов, поскольку, во-первых, вирусы просто не успевают их инфицировать из-за быстрого роста прилегающих тканей и, во-вторых, в зоне меристемы из-за быстрого деления клеток резко уменьшено количество плазмодесм (цитоплазматических мостиков) между клетками, и это сильно затрудняет движение вирусов из зараженных в соседние здоровые клетки. Размер зоны, свободной от вирусов, зависит от оздоравливаемой культуры. Например, для картофеля размер вычленяемых меристем не должен превышать 0.1 - 0.2 мм.

4. Химиотерапия с применением антивирусных препаратов. В питательные среды для культивирования меристем добавляют ферменты, разрушающие вирусные нуклеиновые кислоты (рибонуклеазу А и другие нуклеазы), вещества, ингибирующие размножение вируса, большинство из которых представляет собой синтетические аналоги или производные нуклеотидов, а также стимуляторы антивирусного иммунитета растений – метилсалицилат, салициловую кислоту, другие фенолкарбоновые кислоты (например: феруловую, сиреневую), арахидоновую кислоту, олигосахарины и др. В

некоторых случаях исходный материал также обрабатывается антивирусными веществами.

5. Тестирование микроклонов на наличие вирусов и вироидов. Эта работа проводится после регенерации из меристемы побега и первого цикла его размножения до нескольких штук. Отдельно анализируется каждый клон, полученный из единственной меристемы. Если доказано, что клон не содержит инфекции, его включают в программу дальнейшего широкомасштабного размножения элитного сортового материала. Применяют два современных метода анализа патогенов: иммуноферментный и полимеразную цепную реакцию (ПЦР-метод). Первый из них является наиболее современным, чувствительным и точным вариантом серологического теста, основанного на специфическом взаимодействии антител с белковыми компонентами, входящими в состав патогена. Поэтому этот метод не пригоден для вироидов, которые не содержат молекул белка. ПЦР-метод непосредственно определяет присутствие генетического материала патогена (т.е. нуклеиновой кислоты) и поэтому является полностью универсальным и очень чувствительным.

После оценки содержания вирусов и вироидов и отбора здоровых клонов пробирочных растений приступают к массовому клональному микроразмножению этих растений, получению из них исходного материала, затем суперсуперэлиты и далее по стандартной схеме производства высококачественного посадочного материала картофеля.

Культивирование меристем осуществляется на богатых питательных средах с добавлением витаминов и фитогормонов, из которых наиболее эффективны цитокинины. Состав питательной среды для культивирования меристем картофеля в мг/л:

Минеральная часть МС Фолиевая к-та 0.5

Сахароза 20000 Рибофлавин 0.5

Глюкоза 20000 Биотин 1.0

Гидролизат казеина 1000 Пантотенат 10

Мезоинозит 100 Цианкобаламин 0.015

Тиамин 1 Аденин 40

Пиридоксин 1 Кинетин 0.5

Никотиновая к-та 2 Гиббереллин 1.0

Уголь активиров. 10000 Агар-агар 7000

Цель работы: Практическое ознакомление с методикой выделения меристем картофеля, как составной частью системы его оздоровления.

Оборудование: Стереомикроскоп с максимальным увеличением не менее 28 (МБС-10) - 2-3 шт, стерильные пробирки, стерильный стаканчик на 100 мл с делениями, электроплитка, спиртовка, стаканчик на 50-100 мл для стерилизации инструмента, стаканчик на 100-150 мл, глазные пинцеты – 4 шт, скальпели – 4 шт, торцевые ножи - 2шт, препаровальные иглы – 2 шт.

Ход работы

1. Разлить по пробиркам предварительно расплавленную на электроплитке питательную среду для культивирования меристем. На поверхность застывшей среды прилить 30 мкл раствора РНКазы А, стерилизованной дробным кипячением (этот фермент является термостойким), или другого антивирусного вещества в концентрациях, указанных преподавателем.

2. Ростки картофеля отделить от клубней и укоротить до размера 3-5 см, чтобы они помещались в стаканчик для стерилизации. При оздоровлении от вирусов использовать только апикальные меристемы!

3.Подготовленный растительный материал стерилизовать 0.1% раствором сулемы в течении 5 мин и затем промывается 3 - 4 раза стерильной дистиллированной водой и обсушивается стерильной фильтровальной бумагой.

4. Под стереомикроскопом последовательно удалить с апикальной части ростков картофеля зачатки листьев сначала при увеличении 14, а затем 28, стерилизуя несколько раз инструмент в пламени спиртовки по мере приближения к меристеме. Препаровальной иглой подрезать меристематический купол, обычно с одним очень мелким начинающим развиваться листовым примордием, так чтобы ее размер не превышал 0.1-0.2 мм и перенести на питательную среду.

5. Культивировать меристемы до получения побегов. Пронаблюдать и зарисовать их развитие через 2, 4 и 6 недель.

Контрольные вопросы: 1.Перечислите этапы освобождения растительного материала от вирусов. 2.Почему меристемы оказываются свободными от вирусов? 3.Какого размера должны быть выделенные меристемы? 4.Какие методы применяются для обнаружения вирусов и вироидов в растительных тканях? 5.В чем заключается разница строения этих двух типов патогенов и как это сказывается на применимости методов их анализа?

1 234

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: