Рост и развитие микроорганизмов

ГЛАВА 4. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

Накопительные и чистые культуры микроорганизмов. Из-за малых размеров микроорганизмов работа в лаборатории проводится не с одной особью, а с популяцией организмов, или культурой. Культура микроорганизмов, состоящая из клеток одного вида, носит название чистой культуры. Если число видов два или больше, то говорят о смешанной культуре.

Рост и развитие микроорганизмов

Для выращивания любой культуры необходимы: 1) жизнеспособный посевной материал; 2) источники энергии и углерода; 3) питательные вещества для синтеза биомассы; 4) отсутствие ингибиторов роста; 5) соответствующие физико-химические условия (температура, рН среды, наличие или отсутствие кислорода и др.).

В благоприятных условиях в клетках микроорганизмов начинаются ферментативные процессы, обмен веществ с окружающей средой. Из веществ, проникших в клетку, образуются внутриклеточные вещества и структурные элементы. Одновременно идут процессы распада веществ – диссимиляции. Если анаболические процессы преобладают над катаболическими, наблюдается рост клетки, увеличение ее размеров. Достигнув определенных размеров в соответствующей фазе развития, клетка может начать размножаться.

В результате роста и размножения в питательной среде увеличивается количество клеток. Из-за малых размеров микроорганизмов оценка роста происходит не для индивидуального организма, а для популяции.

В развитии микроорганизмов в несменяемой питательной среде наблюдается несколько фаз. Графическое отражение роста микроорганизмов носит название кривой роста (рис 4.1).

Посевной материал попав в свежую полноценную среду, сразу не начинает размножения. Этот период называют лаг-фазой I. Только после определенного времени, иногда через несколько часов, клетки приспосабливаются к среде и окружающим условиям. В этот период активируются ферменты, а также, если
Рис.4.1. Фазы роста культуры

это необходимо, синтезируются новые ферментные системы. В период лаг-фазы стремительно возрастает количество нуклеиновых кислот, особенно РНК, что необходимо для биосинтеза белков.

После лаг-фазы следует логарифмическая, или экспоненциальная, фаза II, в которой клетки размножаются с максимальной для данной культуры скоростью. Вследствие этого запас необходимых питательных веществ в среде уменьшается, кроме того, происходит накопление различных продуктов обмена веществ, которые в определенной концентрации могут мешать нормальному протеканию биохимических процессов обмена веществ. Иногда в питательной среде накапливается так много клеток, что не хватает пространства, (поверхности для новых поколений клеток). Именно через поверхность происходят процессы обмена – попадание питательных веществ в клетку и выведение метаболитов. Если клетка находится в тесном окружении других клеток, то площадь поверхности уменьшается и вместе с тем снижается интенсивность процессов обмена. Скорость роста культуры также уменьшается, если сокращается поверхность клеток на единицу объема. Это происходит при увеличении размеров клеток и, таким образом, особенно для клеток сферической формы, значительно ухудшаются условия питания.

В ходе интенсивного роста и размножения внутри закрытой системы негативное влияние лимитирующих факторов увеличивается и в результате скорость роста уменьшается, наступает фаза замедленного роста III. Через определенное время в стационарной фазе IV масса клеток в питательной среде достигает максимального уровня, процессы деления и отмирания клеток в популяции находятся в динамическом равновесии. Затем наступает период, когда число отмерших и автолизированных клеток превышает прирост. В результате количество биомассы уменьшается – наступает фаза отмирания V.

Следовательно, наиболее интенсивно рост и размножение происходят в логарифмической фазе, где еще не действуют лимитирующие факторы.

Для характеристики физиологического развития культуры микроорганизмов и используют следующие параметры:

· концентрация клеток (клеток/мл);

· время генерации – промежуток времени, за который число клеток удваивается;

· константа скорости деления – число удвоений в час;

· скорость роста культуры – изменение количества биомассы в единицу времени;

· константа скорости роста.

Количество биомассы можно характеризовать по сухой массе клеток на единицу объема (мг/л, г/л кг/м), в том случае если клетки имеют примерно одинаковые размеры – по числу клеток в единице объема (млн./мл, млрд./мл).

Количественная оценка роста микроорганизмов требует определения числа клеток в конкретный момент. Все эти методы подразделяют на прямые и косвенные. Прямые методы предполагают непосредственный подсчет клеток под микроскопом – в счетных камерах или на фиксированных мазках.

К косвенным методам относятся:

· метод предельного разбавления. При этом методе культуру постепенно разбавляют и определяют, при каком разбавлении не наблюдается ее роста;

· посев на твердые питательные среды;

· центрифугирование или фильтрция культуральной жидкость через мембранный фильтр и дальнейшее высушивание полученной биомассы до постоянной массы;

· нефелометрия, измерение поглощения света клеточной суспензии, что пропорционально числу и размерам клеток;

· определение содержания азота в биомассе, полученной из определенного объема питательной среды;

· определение по интенсивности выделения какого-либо вещества (газа, кислоты и др.).

При росте в экспоненциальной фазе увеличение количества клеток N происходит в геометрической прогрессии: 2⁰→2¹→2² →2ⁿ и через некоторое время t определяется по формуле

N_t= N₀∙ 2ⁿ,

где N_o – начальное количество клеток; п –число генераций (делений).

Прологарифмировав это выражение, получим

IgN_t = IgN₀ +nIg2

Откуда число генераций

n=(IgN_t − IgN₀)/Ig2

Тогда константа скорости деления

v=n/t =(IgN_t − IgN₀)/Ig2(t − t₀)

Время генерации

g=t/n =1/v

Самые быстрорастущие организмы – фотобактерии – удваиваются каждые 8 мин. Е. coli в оптимальных условиях делится через 20 мин.

Например, сравним продуктивность 500 кг биомассы разных организмов за 1 сут (привес):

корова – 0,5 кг (масса морской свинки);

соя –5 кг (масса кошки);

дрожжи – 50 000 кг (масса 10 слонов).

Увеличение биомассы микроорганизмов важно при получении биомассы, как таковой, и при накоплении в культуральной жидкости какого-либо вещества. Для практических целей, выбора технологических режимов культивирования важно иметь сведения о всех вышеупомянутых параметрах.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: