Дифференциальная экспрессия генов

Благодаря разработке таких сложнейших биохимических методик стала возможна проверка гипотезы о дифференциальной экспрессии генов на молекулярном уровне; при этом следует выделить три постулата, которые необходимо подвергнуть проверке.

1. Ядро каждой клетки содержит полный геном, сформированный в оплодотворенном яйце. На молекулярном уровне это означает, что ДНК всех дифференцированных клеток идентична.

2. Неиспользуемые гены в дифференцированных клетках не разрушаются и не мутируют, они сохраняют способность к функционированию.

3. В каждой клетке экспрессируется лишь малая часть генома, при этом синтезируемая фракция РНК специфична для клеток данного типа.

Рис.10.15. Гибридизация in silu кДНК желточного белки с политенными хромосомами hi слюнных желез личинки Drosophila. Темные зерна (указаны стрелкой) показывают, где радиоактивная кДНК желточного белка (приготовлена измPHK желточного белка) связалась с хромосомами. (Из Barnett et al., 1980. Фотография с любезного разрешения Ρ. С. Wensink.)

Идентичность геномов

Мы уже рассмотрели некоторые генетические и эмбриологические данные, свидетельствующие об идентичности геномов. Аналогичные данные были получены также в ряде биохимических работ с использованием гибридизации нуклеиновых кислот.

Первое крупномасштабное молекулярное исследование идентичности ДНК в организме было выполнено в 1964 г. (McCarthy, Hoyer, 1964). Оказалось, что одноцепочечные ДНК, выделенные из мышиных клеток всех типов, с одинаковой эффективностью подавляют гибридизацию одноцепочечной ДНК с генами зародышей мыши. Это с достаточной убедительностью говорит о том, что ДНК в клетках всех типов одинакова по числу и типу последовательностей.

Данные о присутствии в дифференцированных клетках определенных генов, которые не синтезируют специфический для них продукт, были получены с помощью метода, названного гибридизацией in situ (Mary Lou Pardue, Gall, 1970). Гибридизация in situ проводится с политенными хромосомами, денатурированными таким образом, что цепи множественных спиралей ДНК уже разделены, однако хромосомы все еще видны на препаратах. Радиоактивную РНК или кДНК добавляют к денатурированной ДНК и затем после соответствующего периода инкубации препарат отмывают. В ходе инкубации РНК способна связаться с кодирующими ее участками ДНК. После промывки препараты покрывают прозрачной фотографической эмульсией. Радиоактивность связанной РНК сенсибилизирует зерна серебра в эмульсии, которые при проявлении эмульсии образуют черные точки над соответствующим диском хромосомы. Следовательно, с помощью РНК для определенного продукта можно выявить диск, в котором она синтезируется. На рис. 10.15 приведен радиоавтограф, который показывает локализацию генов для одного из желточных белков у дрозофилы. ДНК дрозофилы была клонирована и скринирована с помощью частично очищенной мРНК к этому белку; было обнаружено несколько клонов, ДНК которых обладала способностью направлять синтез желточного белка. Эти клоны были выращены и гены желточного белка выделены. Один из этих клонов был использован для получения радиоактивного зонда, который гибридизовали с препаратами политенных хромосом из клеток слюнных желез. Как видно из рисунка, полученная кДНК связывается с одним определенным диском. Однако слюнные железы не синтезируют данный белок. Единственными клетками, синтезирующими желточные белки в норме, являются ооциты и клетки жирового тела взрослой самки. Таким образом, было показано, что ген, активный исключительно в клетках жирового тела взрослой особи и в ооцитах, присутствует в хромосомах слюнных желез личинки.

Стабильность генов

Оказалось возможным показать также, что гены, неиспользуемые в дифференцированных клетках, при определенных условиях могут быть активиро-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ______________ 93

Рис. 10.16. Активация молчащих генов при слиянии соматических клеток. Слияние тетраплоидной опухолевой клетки из печени крысы и диплоидного фибробласта мыши приводит к образованию гибридной клетки, которая экспрессирует гены мыши, специфичные для печени.

ваны и что они могут продуцировать белки, специфичные для клеток других типов. Убедительные данные о реактивации неиспользуемых генов у млекопитающих были получены в лаборатории Μэри Вейс (Peterson, Weiss, 1972; Brown, Weiss, 1975) при использовании методики слияния дифференцированных клеток различных типов. Клетки могут сливаться естественным образом (как в случае развития мыши), или их можно искусственно стимулировать к слиянию, воздействуя такими агентами, как инактивированный вирус Сендай (вирус мышиной кори) или полиэтиленгликоль¹. При слиянии клеток возникает ситуация, при которой два ядра оказываются в обшей цитоплазме (рис. 10.16). В благоприятных условиях оба ядра гибридной клетки одновременно войдут в митоз и в результате образуют гибридное ядро, содержащее хромосомы из родительских клеток обоих типов. В большинстве случаев, когда клетки двух различных типов сливаются друг с другом, полученный гибрид теряет свойства, характерные для родительских клеток. В результате слияния опухолевых клеток из печени крысы с фибробластами мыши Вейс смогла получить гибриды, содержащие два набора хромосом из печени на один набор из фибробластов. Эти клетки сохранили способность синтезировать белки, специфичные для печени крысы, такие, как альбумин, альдолаза и тирозинаминотрансфераза (ТАТ). Более удивительно, что кроме этих белков они синтезировали также мышиные альбумин, альдолазу и ТАТ – три белка, которые никогда не синтезируются фибробластами. Фибробласты мыши сохранили гены, специфичные для печени, в форме, которая допускает их экспрессию в определенных условиях. Эта ситуация соответствует общему правилу развития животных: в процессе дифференцировки клеток необратимых генетических изменений не происходит.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: