Дифференцировка клеток как основа каллусогенеза

Культура изолированных тканей обычно представлена каллусными и гораздо реже опухолевыми тканями. Каллусная ткань об­разуется в результате повреждения на целых растениях, а также в стерильной культуре на эксплантах — фрагментах ткани или органа, используемых для получения первичного каллуса. Возникно­вение каллуса связано с неорганизованным делением (пролифе­рацией) деф-х клеток.

Деф-ка — основа создания каллусной ткани. В процессе дифференцировки клетки теряют способность делиться. Деф-ка — это возвращ-е кл-к в меристематическое сост-е, при кото­ром они сох-т спос-ть к дел-ю. У интактных растений деф-ка и индукция каллусогенеза возн-т вслед­ствие образ-я раневых гормонов (травматиновая к-та) при мех-ом повреждении. Обяз-ое усл-е дедифферен-цировки тканей экспланта и превращения их в каллусные клетки, помимо повреждения, — присутствие ауксинов и цитокининов. Среди ауксинов чаще всего используют 2,4-D (2,4-дихлорфенок-сиуксусную кислоту), ИУК (индолил-3-уксусную кислоту), НУК (а-нафтилуксусную кислоту), причем наибольшую активность проявляет 2,4-D. Из цитокининов в искусственные питательные среды обычно вносят кинетин, 6-БАП (6-бензиламинопурин), зеатин. Наиболее активны 6-БАП и зеатин.

Во время процесса дедифференциации, который у всех клеток сходен, клетки должны утратить характерные черты исходной ткани. В первую очередь они теряют запасные вещества — крахмал, бел­ки, липиды. В них разрушаются специализированные клеточные органеллы, в частности хлоропласта, но возрастает число амилопластов. Кроме того, разрушается аппарат Гольджи, перестраи­ваются эндоплазматический ретикулюм и элементы цитоскелета.

Через несколько часов после перенесения экспланта в условия invitro начинается новый синтез белка. Он связан, вероятно, с механическим повреждением и действием гормонов, сохранив­шихся в экспланте с момента его изоляции из растения. Когда данные гормоны израсходуются, синтез белка прекращается. Если в это время клетки будут культивироваться на питательной среде, содержащей ауксины и цитокинины, то начнется каллусогенез, т.е. в результате дедифференцировки и деления клеток будет образовываться первичный каллус. Таким образом, специализи­рованная клетка растительной ткани становится каллусной в ре­зультате дедифференцировки, т.е. восстановления у нее способ­ности к делению.

48. Типы культивирования клеток и тканей.Культив-е кл-к представляет собой процесс, посредством которого отдельные кл-ки (или единственная кл-ка) прокариот и эукариот искус-но выращ-тся в контролируемых усл-х. На практике термин «культура кл-к» относится к выращ-ю кл-к, относящихся к одной ткани, полученных от многокл-х эукариот, чаще всего жив-х. Этапы: Выделение кл. - для культ-ия вне организма живые кл. могут быть получены несколькими способами: кл. могут быть выделены из крови, но к росту в культуре способны только лейкоциты; могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов как коллагеназа, трипсин, разрушающих внеклеточный матрикс. Культуры кл., взятых непосредственно от объекта, называются первичными.Существуют иммортализованные («бессмертные») линии кл., способные размножаться бесконечно.Культивирование кл.–кл. выращивают в спец. пит-х средах, при пост. Темп., а для кл. млекопитающих обычно необходима также газовая среда, поддерживаемая в инкубаторе клеточных культур. Пит. Ср. для разных культур кл. различаются по составу, pH, концентрации глюкозы, составу факторов роста. Факторы роста в средах добавляют вместе с сывороткой крови. Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры кл. вирусами. Кл.можно выращивать в суспензии, либо в адгезивном состоянии. Некоторые кл. (кл. крови) в естественных условиях сущ. во взвешенном состоянии. Существуют также линии кл., искусственно измененных так, чтобы они не могли прикрепляться к поверхности; это сделано для того, чтобы увеличить плотность кл. в культуре. Для выращивания адгезивных клеток требуется поверхность, например, культура ткани, или пластик, покрытый элементами внеклеточного матрикса для улучшения адгезивных свойств, а также для стимулирования роста и дифференцировки. Особенности выращивания клеток.При выращивании кл., из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре. В результате чего - следующие проблемы: Накопление в питательной среде продуктов выделения, в том числе токсичных, омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность. Скопление большого количества клеток оказывает негативное влияние на клеточный цикл, рост и деление замедляются, а клетки начинают стареть и отмирать.Пассажированиекл.- (разделение) —отбор небольшого количества кл.для выращивания в другом лабораторном сосуде. Если культура быстро растет, это необходимо делать регулярно, поскольку в среде истощаются питательные вещества и накапливаются продукты метаболизма.

49.МОРФОГЕНЕЗ В КАЛЛУСНЫХ ТКАНЯХ КАК ПРОЯВЛЕНИЕ ТОТИПОТЕНТНОСТИ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ

Дифференцировка каллусных тканей.используют изолированные ткани, клетки, протопласты, культи­вируемые в стерильных условиях. Преимущество - нет необходимости постоянно учитывать ре­зультаты взаимодействия органов в целостной системе раститель­ного организма. Во-первых, это вторичная дифференцировка разной степени сложности. Во-вторых, в клетке может сфор­мироваться состояние стойкой дедифференцировки («привыка­ние»), а, следовательно, способность расти на безгормональной среде. В-третьих, каллусная клетка проходит свой цикл развития, завершающийся ее старением и отмиранием.

Наибольший интерес вызывает первый путь, фактически пред­ставляющий Вторичная дифференцировка каллусной клетки может завер­шиться образованием в каллусной ткани отдельных дифференци­рованных клеток. Они имеют определенное строение и выполняют специфические функции. Примером служит образование эпибла-стов — клеток, в которых запасаются вторичные метаболиты. К самым сложным видам вто­ричной дифференцировки относятся органогенез — образование органов и соматический эмбриогенез — образование из сомати­ческих клеток эмбриоидов, биполярных зародышеподобных струк­тур. Все эти типы дифференцировки возможны только благодаря тотипотентности

Все каллусные клетки, готовые ко вторичной дифференцировке, т.е. детерминированные, характеризуются общими чертами. Эти клетки — «клеткиинициали»— образуют утолщенную клеточную стенку, обособляясь от остальных каллусных клеток. Для них ха­рактерно более крупное ядро, большее количество запасных ве­ществ, меньшие размеры вакуолей. В «клеткахинициалях» начи­нается синтез определенных белков, интенсифицируется пентозофосфатный путь расщепления гексоз. Очень важно, что между этими клетками, формирующими меристематические очаги, восстанавливаются плазмодесмы, которые практически отсутству­ют в массе каллусных клеток.

Гистогенез. Главную роль в преобразовании каллусных клеток в сосудистые элементы играют фитогормоны, в основном ауксины. Опыты по влиянию апикальной меристемы побега (место синтеза ауксинов) на гистогенез в каллусной ткани показали, что ниже места прививки апекса в каллусной ткани начинали образовы­ваться сосудистые элементы. Тот же эффект наблюдался при на­несении на каллус ауксина с сахарозой.

Большое значение в создании новых форм растений для изуче­ния взаимодействия ядерного генома и геномов органелл имеет способность изолированных протопластов сливаться, образуя гиб­ридные клетки. Таким способом можно добиться получения гиб­ридов от растений с разной степенью таксономической удален­ности, но обладающих ценными хозяйственными качествами.

Впервые протопласты были выделены Дж. Клернером в 1892 г. при изучении плазмолиза в клетках листа телореза (Stratiotesabides) во время механического повреждения ткани. Поэтому этот метод назван механическим. Он позволяет выделить лишь небольшое ко­личество протопластов (выделение возможно не из всех видов тка­ней); сам метод длительный и трудоемкий. Современный метод вы­деления протопластов заключается в удалении клеточной стенки с помощью поэтапного использования ферментов для ее разруше­ния: целлюлазы, гемицеллюлазы, пектиназы. Этот метод получил название ферментативного.

Изолированные протопласты можно культивировать. Сразу же после удаления ферментов у прото­пластов в культуре начинается образование клеточной стенки. Протопласт, регенерировавший стенку, ведет себя как изолиро­ванная клетка, способен делиться и формировать клон клеток. Регенерация целых растений из изолированных протопластов со­пряжена с рядом трудностей. Получить регенерацию через эмбрио­генез удалось пока только у растений моркови. Стимуляцией пос­ледовательного образования корней и побегов (органогенез) до­бились регенерации растений табака.

50.

51. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ В СИНТЕЗЕ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ. Метод культуры изо­лиров. тканей широко используется в с∕х и промышл.производстве .Примером м.служить массовое клональное микроразмножение плодовоовощных и де­коративных растений, а также их оздоровление от вирусных и др. инфекций. С помощью культуры in vitro можно расширить возможности селекционной работы: получать клоны клеток, а за­тем и растения с запрограммированными свойствами. Благодаря способности кл-к синтезир-ть в культуре вторич. метабо­литы возникла отрасль промышленности, осуществл. био­логич-й синтез вещ-в, необходимых человеку.Синтез вторичных метаболитов. Растения всегда служили источ­ником пищи, эфирных масел, красителей и, конечно же, лекар­ств-х соединений. Так, мак снотворный -источник болеутоляющего вещ-ва — кодеина; Способность интактных раст. синтез-ть различ.соединения привела к предположению, что тем же свойством будут обладать кл-ки и ткани этих растений, выращ-е в стер-х условиях. В наст.время промыш. синтез вторич.метаб-в –перспектив. направление. Синтез вторич. метаб-в происходит глав. образом в суспензионной куль­туре клеток, в регулируемых условиях, поэтому он не зависит от климатич-х факторов, от повреждения насекомыми. Культуры выращив-т на малых площадях в отлич. от больших массивов плантаций с необход. растениями. К-ры клеток растений м.синтез-ть практически все классы соединений вторич. обмена, довольно часто в колич-х, в несколько раз превышающих их синтез в целых растениях. Кроме того, в культурах м.начаться синтез веществ, не харак-х для исход. растения, либо расширяется набор синтезир-х соединений. В ряде случаев в клет.кул-ре образ. вещ-ва, кот.синтез.интактным растением на ювенильной фазе развития, либо вещества, содержав-ся в клетках филоген-ки более ранних групп растений. Синтез вторич. соединений м. коррелировать с процес­сом дифференц-ки в к-ре клеток. У большого числа кул-р вторич. метаболиты синтезир-ся и накап-ся в значит-х колич-х .Важная особен-ть культивир.популяции клеток стабильность в отношении синтеза и накопления продуктов вторич.синтеза. Синтез вто­рич. метаболитов в культивир-х кл-х связан с внутри­клеточ.органеллами, в основном с пластидами и эндоплазматич.ретикулумом. Большое влияние на рост суспензион. среды оказы­вает ее непрерывное перемешивание, кот. обеспеч-т хоро­шую аэрацию и предотвращает осаждение клеток. В лабораторных условиях перемешивание достигается благодаря использованию качалок или роллерных установок. При промыш. выращи­вании суспенз. кул-р прим. спец. системы, в кот. идут увелич. биомассы и синтез вторич. соеди­нений, — биореакторы. Сущ-т еще 1 технология получения вто­рич. метаболитов с помощью иммобилиз-х кл-к кул-ры, т. е. помещение их в опред. носитель или адсорбция в нем. Носитель с клетками помещают в питательную среду. Клет­ки остаются живыми. Они прекращают рост, но продолжают син­тез метаболитов, выделяя их в среду.Часто синтез вторич. метаболитов в суспензион­.культуре останавл. на промежуточных этапах, не дохо­дя до необходимого продукта. Получ. продукта возможно бла­годаря процессу биотрансформации. Сущность его : из­менениие промежут. метаболитов с помощью культур др. растений или кл. бактерий. Биотрансф. эффек­тивна в бактериал-х кл-х, поэтому растит. клетки используют, когда процесс не осущ.в клетках микро­организмов. Большой интерес пред-т также дальнейшее разви­тие методов биотрансформации метаболитов и иммобилизации культив-х клеток.

52. Биотехнологии,облегчающие селекционный процесс.

Ускорение и облегчение селекционного процесса, а также создание растений с новыми качествами–это направления,которые достаточно успешно развиваются с помощью технологий клеточной инженерии,культуры клеток и тканей.Некоторые из указанных технологий стали традиционными,др.нах-ся на начальных этапах разработки.Наконец есть такие методы,которые явно вышли из ранга вспомогательных,ускоряющих селекцию технологий.К ним можно отнести криосохранение генофонда-технологию,в настоящий момент приобретшую экологическую направленность;или клональное микро размножение растений,тесно связанное с проблемой их оздоровления от вирусных и др.инфекций.Одна из наиболее важных технологий этой группы-оплодотворение invitro,помогающее предотвратить прогамнуюнесовместимость,которая может быть вызвана следующими причинами:1)генетически детерминированное несоответствие секрета рыльца материнского растения и пыльцы отцовского,которое тормозит рост пыльцевых трубок на рыльце пестика;2)несоответствие длины столбика пестика и пыльцевой трубки,в рез-те чего пыльцевая трубка не достигает семяпочки (гетеростилия); 3)тканевая несовместимость партнеров,приводящая к остановке роста пыльцевой трубки в любой момент ее прорастания от рыльца пестика до микропиле семяпочки (гаметофитный тип несовместимости).

Преодоление програмной несовместимости возможно благодаря выращиванию в стерильных условиях изолированной завязи с нанесенной на нее пыльцой или изолированных кусочков плаценты с семяпочками,рядом с которыми или непосредственно на ткани которых культивируется пыльца.

Значительным препятствием для селекции служит также постгамная несовместимость, вызванная разновременным развитием зародыша и эндосперма при отдаленной гибридизации.В рез-те обр-ся невсхожие щуплые семена.Получить растение из таких семян можно только при использованииметода эмбриокультуры,т.е.выращивания изолированного зародыша на искуственной пит-ной среде invitro. Метод эмбриокультуры широко применяют при межвидовой гибридизации овощных растений, для микроразмножения ценных гибридов,для клеточной селекции.

Большое зн-ние имеет создание гаплоидов,позволяющее ускорить процесс селекции в 2-3 раза.Использование гаплоидных клеток и гаплоидных растений способствует обнаружению экспрессии введенного в клетку генома,редких рекомбинаций,рецессивных мутаций,которые в диплоидных растениях,как правило,маскируются доминантными генами. Из гаплоидных клеток можно выделить протопласты; сливаясь,ониобр-ют гибридные клетки и растения с диплоидным числом хромосом.Обрабатывая гаплоидные клетки колхицином,можно добиться удвоения числа хромосом и получить диплоидные гомозиготные растения.Все это значительно облегчает выявление и стабилизацию необходимых признаков.Кроме селекции гаплоиды применяются также в генно-инжинерных исследованиях. Впервые возможность получения спонтанных гаплоидов при аномальном развитии пыльников,пыльцы и др.объектов была показана в 1964г.С.Гуха и С.Магешвари.В настоящее время в к-ре гаплоидные растения получают из изолированных пыльников (андрогенез),изолирован-ных семяпочек (гиногенез); из гибридного зародыша,у которого в рез-те несовместимости потеряны отцовские хромосомы (партеногенез).Новые сорта ячменя-исток и одесский-15-были выведены благодаря комбинации партеногенетического метода с к-рой изолированных зародышей за 4 года вместо 10-12лет,необходимых для обычной селекции.

53.Клональноемикроразмножения растений

Клональное размножение- это использование техники ин витро для быстрого неполового получения растений, идентичных исходному. Обязательным условием клональногомикроразмножения является использование объектов, полностью сохраняющих генетическую стабильность на всех этапах.
Этому условию удовлетворяют апексы и пазушные почки органов стеблевого происхождения.
Этапы и преимущества микроклонального размножения
Процесс клональногомикроразмножения можно разделить на несколько этапов:
1. Выбор растения-донора, изолирование и стерилизация эксплапта, создание условии для его роста на питательной среде ин витро.
2. Собственно размножение путем:
а) размножения черозкаллусную и суспензионную культуру;
б) индукции образования адвентивных почек тканями листа, стебля, чешуйками и донцем луковиц, корневищем, зачатками соцветий- без образования ими каллусной ткани;
в) стимуляции развития всех пазушных почек экспланта в результате подавления апикального доминирования как химическим путем, так и при микрочеренковании побегов.
3. Укоренение размножаемых побегов и адаптация пробирочных растений к условиям ин витро.
4. Выращивание извлеченных из культуральных сосудов растений в условиях теплицы в почве. Подготовка к реализации или высадке в поле.
Преимущества клоналыногомикроразмножения растений:
1. Значительно более высокие коэффициенты размножения, достигающие миллиона растений в год, по сравнению с 5-100 растениями от одного, полученными обычными способами за этот срок.2. Миниатюризация процесса, приводящая к экономии площадей, занятых маточными и размножаемыми растениями, и позволяющая поддерживать на относительно небольшой площади в лабораторных условиях круглогодичный рост растений, что дает возможность планировать их выпуск к определенному сроку.3. Оздоровление посадочного материала oт нематод, грибов, бактерий и вирусов, вызывающих болезни растений.4. Возможность создания нужного для селекционера количества копий уникальных генотипов (линий, гибридов, мутантов, трансгенных растений).5. Возможность размножить и укоренить те растения, которые совсем не размножаются или плохо размножаются обычными способами, например, быстрое клональное размножение лучших экземпляров взрослых лесных деревьев, особенно хвойных. Таким образом, имеется реальная возможность создания «банка» или коллекции ценных форм оздоровленных сортов, а также редких и исчезающих видов растении путем длительного хранения пробирочных растении при пониженной температуре.
Однако самой крупномасштабной областью применения клональногомикроразмножения является быстрое размножение вновь созданных и уже существующих ценных хозяйственных сортов с целью получения массового оздоровленного посадочного материала, освобожденного от вирусной инфекции.

Микроклональное размножение
Получение растений, свободных от вирусной инфекции,- только первый шаг использования их в семеноводстве. Следующая важная задача- их ускоренное размножение. Кроме того сам по себе метод микроклонального размножения дает возможность получать в больших количествах растения у таких культур, которые с трудом или совсем не размножаются вегетативно, а также быстро размножить уникальный генотип, например, новый сорт.
Метод позволяет поддерживать на относительно небольшой площади в лабораторных условиях круглогодичный рост растений, что дает возможность планировать их выпуск к определенному сроку. Наконец, благодаря этому методу появилась реальная возможность создания «банка» или коллекции ценных культур.
В настоящее время существует несколько подходов к клональномумикроразмножению растений в культуре ин витро:
1) получение каллусной ткани с последующей индукцией органогенеза;
2) индукция развития побегов непосредственно из ткани эксплантата;
3) пролиферация пазушных побегов.

Эти способы имеют различные коэффициенты размножения, различную степень надежности в отношении сохранения генетической стабильности размножаемых форм растений, а также различаются универсальностью и повторяемостью получаемых результатов.

Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском по сайту: