Сделай Сам Свою Работу на 5

Устройство вирусологической лаборатории.

31. Правила работы в вирусологической лаборатории. Основные требования при работе с вируссодержащим материалом.1. Все работы с вирусами проводят в специально отведенных замкнутых пространствах – боксах. 2. Работают в спецодежде. 3. Работы проводят вблизи пламени горелки. 4. Используют стерильный инструментарий, лабораторную посуду, реагенты. 5. Запрещено пить, курить, принимать пищу. 6. В случае аварии и попадании вируссодержащего материала на стол, руки и халат, проводят дезинфекционные мероприятия. 7 .После окончания работы все твердые отходы помещают в контейнер для автоклавирования, жидкие отходы в дезраствор, инструментарий в стерелизатор. Стол и руки обрабатывают дезраствором. Правила работы с вируссодержащим материалом: 1. Недопущение распространения вирусной инфекции за пределы лаборатории. 2 . Недопущение контаминации (загрязнения) вируссодержащей суспензии посторонней микрофлорой. 3. Соблюдение мер личной безопасности. 1)Наглухо застегнутый халат. 2)В лаб-ии не принимать пищу и воду. 3)Чистота и порядок на раб. месте, не должно при работе быть лишних предметов. 4)Работать сидя, не отвлекаясь. 5)Переливать жидкий вирус только над дизенфецир. жидкостью. 6)не брать пипеток в рот, пользоваться грушей. 7)Использ. предметы собирать в стерилизатор. 8)Запр. выносить ПМ за пределы ауд. 9)При разлитии исл. материала сообщить преподавателю для проведения дезинфекции. 10)После работы привести в порядок раб. место.

32. Хранение и уничтожение вирусов: цели, методы. Направления борьбы с вирусными болезнями.Хранение и консервация. Цель: 1. Научно-исследовательская работа. 2. Лабораторная диагностика. 3 . Изготовление вакцин. Методы: физические – 0+4 – неделя, -20 – 6 мес-1 год, -70 –6-10 лет, -196 (жидкий азот) – 12-15 лет. Леофильная сушка (высущивание под вакуумом из замороженного состояния) 0+4 до 12 лет. Химический: 50% р-р глицерина (только пат материал, кроме бешенства!).Уничтожение стерилизация. Цель: борьба с вирусными болезнями. Методы: физические 100гр. – 30 мин спецодежда, инструменты, фламбирование – прожигание пламенем, сухой жар – пластиковая посуда, автоклавирование (выс темп, выс давление) – автоклавируют все, УФ лучи –помещения, боксы. Химические: кислоты (соляная, борная), едкие щелочи (КОН, NaOH), окислители (перекись водорода, марганц), хлоросодержащие (хлорамин), современные средства (Аламинол, Бианол).Направления борьбы с вирусными болезнями. Профилактика: специфическая: активная (вакцинация), пассивная (серопрофилактика), неспецифическая: ветсанмероприятия (карантин, дезбарьер), зоотехнические (уход, кормление, содержание). Диагностика: 1. Предварительный диагноз. 2. Эпизоотологические данные. 3. Клинические признаки. 4. Патанатомические изменения. 5. Отбор пат материала. 6.лабораторные исследования. 7. Окончательный диагноз.

 

33. Правила отбора, транспортировки и хранения патологического материала. Подготовка первичного патологического материала для лабораторных исследований.При отборе патматериала учитывают патогенез и тропизм вируса. 1. Патматериал отбирают с учетом мест локализации вирусаи путей его выделения из организма. 2. Пм берут во время яркого проявления клинических признаков. 3. Соблюдают правила антисептики. 4. Доставляют в лабораторию не позднее 2 часов с момента взятия патм в термосе со льдом или термоконтейнере.Вид патматериала. От больных животных:1. Смывы со слизистых оболочек ватно-марлевыми тампонами. 2. Кровь, если вирус репродуцируется в клетках крови (сыворотку).3. Фекалии (кишечные инфекции), моча (урогенитальные инфекции), сперма. 4. Кусочки пораженной кожи (ящур, оспа). От павших животных: 1. Кусочки 10-20 гр органа на границе здоровой и пораженной ткани паренхиматозного органа (печень, почки, селезенка). 2. Региональные лимфоузлы. 3. Кусочки пораженных органов.Подготовка патматериала. Смывы со слизистых оболочек: Ватно-марлевый тампон отполаскивают в стерильном р-ре, отжимают и удаляют. Смыв центрифугируют 1500-3000 об в мин 10-15 мин. Надосадочную жидкость переносят в стерильную пробирку, добавляют антибиотик (стрептомиц или пеницил 2 ч при t 24 гр). Проводят бактериологический контроль (посев на питат среду). Если микрофлора отсутствует, то можно использовать для вирусологического исследования. Кусочки органов: помещают в фарфоровую ступку и растирают со стерильным песком до гомологичной массы. Добавляют стерильный физраствор (1:10). Суспензию центрифугируют при 1500-3000об в мин 15-20 мин. Надосадочную жидкость переносят в стерильную пробирку, добавляют антибиотик (стрептомиц или пеницил 2 ч при t 24 гр). Проводят бактериологический контроль (посев на питат среду). Если микрофлора отсутствует, то можно использовать для вирусологического исследования.

34. Методы экспресс диагностики вирусных болезней. Индикация вируса в патологическом материале. 1.Обнаружение – световая микроскопия крупных вирусов (Poxviridae оспа), электронная микроскопия.2.Обнаружение телец-включений. (тельца Бабе-Шенегри при бешенстве)Тельца включения – это внутриклеточные включения, образующиеся в клетке при рапродукции в них некоторых вирусов. Тельца включения чаще всего находятся в цитоплазме(чаще это РНК вирусы, кроме оспы)Оспа кур- т. Боллингера, чума плотоядных –т. Ленца, вирус Бешенства –т.Бабеша-Негри(при обнаруж их в мазках отпечатках павших животных диагноз бешенство считается доказанным).3.Обнаружение вирусных антигенов: серологические реакции. В основе лежит спос-ть Ат взаимодействовать со специфическими гомологичными Аг в прбирке(in vitro)с образованием комплекса Аг-Ат. Обычно источником Ат служит сыв-ка крови жив-го=>эти р-ции наз-ся серологическими. РИФ(реакция иммунофлюорисценции. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом). ,ИФА – иммуно-ферментный анализ. АТ-ферментным комплексом дает цветную реакцию , РНГА (реакция непрямой гемагглютинации Эритроциты нагружают АГ и при образовании комплекса АГ-АТ происходит агглютинация эритроцитов ) , РСК - реакция связывания комплемента. Задержка гемолиза – реакция положительная. Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-системой – реакция отрицательная , РДП- реакция диффузной преципитиции. Метод обнаружения – образование контура преципитации.4.Обнаружение вирусных НК (ДНК-зонды и ПЦР – полимеразно-цепная реакция) Не серолог. р-ция,напр-на на обнар-ие вир-й нукл-й к-ты(генома). Принцип:у выд-й из пат мат вир-й нукл к-ты многократно воспроизводят(копируют) опред-й наиболее консервативный уч-к «in vitro», а затем его идентифицируют .5.Обнаружение активной формы вируса путем биопробы (лабораторные животные, куриные эмбрионы, культура клеток) экспериментальное заражение материалом от больных жив. лаб. или естественно восприимчивых жив.6.Обнаружение гемаглютининов у гемаглютинирующих вирусов. Геагглютинирующ вирусы способны агглютинировать эритроциты животных определенных видов в условиях соответствующих температур и рН среды. Иногда используют реакцию гемагглютинации (РГА) для обнаружения гемагглютинирующего вируса в материале.

35. Культивирование вирусов. Живые системы: классификация, характеристика, требования при работе, достоинства и недостатки. Лаб жив:белые мыши и крысы ,кролики, хомячки, мор свинки. Требования:1)получ из питомников, благопр по инф заб-м;2) должны быть того вида и возраста, кот наиболее чувствителен к данному вир; 3)их сод-т в спец помещ-вивариях;4)при зараж жив-х метят 5)животные должны быть линейными (полученными от одной родительской пары). Заражение лабораторных животных. 1.подкожно – спина.2.Внутрикожно – пятка. 3.Внутримышечно –бедро. 4.Внутривенно – в хвост (предварительно растерев горячей водой и пережав).5.Интранозально – капля в нос (предварительно дают слабый эфирный наркоз, что бы предупредить чихание).6.Интероцеребрально – череп аккуратно просверливается иголочкой, не нажимать, капля уходит сама. Все поверхности предварительно смазывают йодированным спиртом. КЭ: нельзя пол-ть специф картину забол-я. Получ-т из благопол-х птицеф-к от здорового пог-я. Скорлупа д б чистая,ср размеров, однозарод, бел цвета. Куриный эмбрион развивается 21 день. Заражение вирусом производится с 5-го по 12-й день. Заражение в аллантоисную полость (болезнь ньюкасла). Все операции проводят асептично с горящей газовой горелкой. Место введения обрабатывают 2% йодированным спиртом, вводят 0,1-0,2 мл жидкости. Отверстие закрывают каплей расплавленного парафина. На скорлупе пишут: название вируса, дату, фамилию. Заражение на ХАО (вирус оспы голубей). Делается отверстие в области воздушной камеры. Делается окошко «А». Отсасывается воздух из воздушной камеры. В окошко «А» капается вирус содержащая жидкость. Отверстие заклеивается лейкопластырем. На скорлупе пишется название вируса, дата, фамилия. КК-кл-ки многокл орг-в,жив-ие и размн-ся вне орг-ма. 3 вида: 1)Первично трипсинизированные культ-ы- полученные непоср-но из орг-ма.(почка, печень,легкие)-монослой(растет в 1слой), те Кл-ки др на др не наползают. 2)Диплоидные к-ры-получ из первичных. М пройти 50+-10 пассажей;диплоидный набор хромосом. 3)Перевиваемые к-ры-были пол-ны из первичных.Их можно перевив из флакона во флакон;неогран-ое кол-во пассажей.Имеет гетероплоидный набор хромосом.Некот м обладать онкогенной активностью-опухоли. 5) перевиваемые КК в суспензии. КК можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного. Лучше это удается сделать из эмбриональных органов, т.к. клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для получения их используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы. Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 часов после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают, обрабатывают трипсином, панкреатином, коллагеназой. Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делится. На стекле формируется слой толщиной в одну клетку, обычно через 3-5 дней. Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохранят жизнеспособность в течение 7-21 дня. При культивировании вирусов в КК удается получать препараты с высоким титром вируса, что важно при получении АГ и вакцин.

 

 

36. Тропизм вирусов. Выбор способа заражения живой системы. Методы заражения куриных эмбрионов.Тропизм- способность вирусов репродуцироваться (размножаться) только в определенных чувствительных клетках данного организма. Эпителиотропные (внутрикожный, подкожный) – вир ящура (пор кл эпителия). Дерматропные ( накожный скарификация) – Оспа (пор кл кожи), пневмортропный (интраназальный) – грипп (пор кл респират тракта), нейротропные( интрацеребрально) – бешенство (пор кл ЦНС), пантропные ( в/венный, в/брюшинный, в/мышечный) – чума (пор все клетки). Куриный эмбрион развивается 21 день. Заражение вирусом производится с 5-го по 12-й день. Заражение в аллантоисную полость (болезнь ньюкасла). Все операции проводят асептично с горящей газовой горелкой. Место введения обрабатывают 2% йодированным спиртом, вводят 0,1-0,2 мл жидкости. Отверстие закрывают каплей расплавленного парафина. На скорлупе пишут: название вируса, дату, фамилию. Заражение на ХАО (вирус оспы голубей). Делается отверстие в области воздушной камеры. Делается окошко «А». Отсасывается воздух из воздушной камеры. В окошко «А» капается вирус содержащая жидкость. Отверстие заклеивается лейкопластырем. На скорлупе пишется название вируса, дата, фамилия. После заражения инкубируют при 37 гр – 5 дней

 

 

.

37. Культура клеток: классификация, получение первичной КК, сравнительная характеристика различных видов КК.Культура клеток (КК) – это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма. Методика трипсинизации тканей и получения однослойных КК.Классификация: 1 по продолжительности жизнеспособности: а) переживающая (клетки не делятся, но сохраняют жизнеспособность длительное время), б) растущая (клетки делятся, но сохраняют жизнеспособность определенное время). 2. По способу культивирования:а) суспензионная (клетки прикреплены на носитель и находятся в виде взвеси), б) однослойная: 1 первичнотрипсинезированная (клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой. КК можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного. Лучше это удается сделать из эмбриональных органов, т.к. клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для получения их используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы), 2 диплоидная - морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся 3 фазами роста, сохраняющая в процессе пассирования кариотип свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая туморогенной активностью при трансплантации хомячкам. Их тоже получают из первичных клеток. В отличие от них имеют ограниченные возможности пассирования. Максимальное число пассажей 50 -\+ 10, затем количество делящихся клеток резко уменьшается и они гибнут. Преимущества перед перевиваемыми КК – 10-12 дней могут быть в жизнеспособном состоянии без смены питательной среды; при смене среды один раз в неделю остаются жизнеспособны в течение 4 недель; особенно пригодны для длительного культивирования вирусов, у них сохранена чувствительность исходной ткани к вирусам. 3 перевиваемая КК – клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лаборатория их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой (при условии замены питательной среды). Получение первичной КК:Кусочки ткани здорового животного расщепляют протеолитическими ферментами на отдельные клетки.1. В лабораторных условиях особой стерильности кусочки ткани измельчают ножницами и отмывают от крови и слизи солевыми растворами. 2. Измельченные кусочки переносят в колбу с магнитом. Заливают 0.25% теплым р-ром трипсина и помещают на магнитную мешалку ( белки межклеточного вещества более чувствительны к трипсину, чем белки клеточной оболочки и расщепляются раньше, жидкость мутнеет). 3. Полученные клетки помещают во флакон и ставят на -4 грС. 4. Оставшийся кусочек снова заливают трипсином и тд , образовавшиеся клетки сливают в отдельный флакон. 5. Полученные клетки центрифугируют 10-15 мин при 1000 об. Клетки оседают на дно, трипсин удаляют. 6. Количество клеток подсчитывают в камере Горяева, доводят до посадочной концентрации 10 в 6 степени, помещают в культурный флакон (матрас), заливают ростовой питательной средой и помещают в термостат 37гр.

 

38. Жизненный цикл культуры клеток. Растворы и питательные среды (примеры). Поддержание КК в лабораторных условиях. 1. Адаптация (клетки оседают на дно и прикрепляются к стеклу) – 3-4 часа. 2.Логарифмический рост (образование монослоя) – 3-4 дня. 3. Стационарная фаза (клетки не делятся, но сохраняют жизнеспособность) – 7-8 дней. Проводится пассаж – перенос клеток в новую питательную среду с целью получения новой популяции клеток. 4.Старение и гибель клеток. Контактная ингибиция- свойство делящихся клеток прекращать деление при соприкосновении стенок соседних клеток. Растворы: 1)солевые – используют как основу для приготовления питательной среды или для манипуляций на КК (р-р Хенкса, р-р Эрла). 2) диспергирующие – р-ры ферментов используют для трипсинизации и снятия клеток со стекла (0.25 % трипсина, 0,002% р-р версена. Питательные среды: 1)ростовые – позволяют клеткам прикрепиться к стеклу и начать делиться (среда 199, среда Игла + 10% сыворотка крови КРС), 2)поддерживающие ((среда 199, среда Игла).

 

39. Живые системы в вирусологии: виды, цели, использование, преимущества, недостатки. Лаб жив:белые мыши и крысы ,кролики, хомячки, мор свинки. Требования:1)получ из питомников, благопр по инф заб-м;2) должны быть того вида и возраста, кот наиболее чувствителен к данному вир; 3)их сод-т в спец помещ-вивариях;4)при зараж жив-х метят 5)жив должны быть линейными (полученными от одной родительской пары). Заражение лабораторных животных. 1.п/к– спина.2.В/к – пятка. 3.В/м –бедро. 4.В/в– в хвост (предварительно растерев горячей водой и пережав).5.Интраноз – капля в нос (предварительно дают слабый эфирный наркоз, что бы предупредить чихание).6.Интероцеребр– череп аккуратно просверливается иголочкой, не нажимать, капля уходит сама. Все поверхности предварительно смазывают йодированным спиртом. КЭ: нельзя пол-ть специф картину забол-я. Получ-т из благопол-х птицеф-к от здорового пог-я. Скорлупа д б чистая,ср размеров, однозарод, бел цвета. Куриный эмбрион развивается 21 день. Заражение вирусом производится с 5-го по 12-й день. Заражение в аллантоисную полость (болезнь ньюкасла). Все операции проводят асептично с горящей газовой горелкой. Место введения обрабатывают 2% йодированным спиртом, вводят 0,1-0,2 мл жидкости. Отверстие закрывают каплей расплавленного парафина. На скорлупе пишут: название вируса, дату, фамилию. Заражение на ХАО (вирус оспы голубей). Делается отверстие в области воздушной камеры. Делается окошко «А». Отсасывается воздух из воздушной камеры. В окошко «А» капается вирус содержащая жидкость. Отверстие заклеивается лейкопластырем. На скорлупе пиш назв вируса, дата, фам. КК-кл-ки многокл орг-в,жив-ие и размн-ся вне орг-ма. 3 вида: 1)Первично трипсинизированные культ-ы- полученные непоср-но из орг-ма.(почка, печень,легкие)-монослой(растет в 1слой), те Кл-ки др на др не наползают. 2)Диплоидные к-ры-получ из первичных. М пройти 50+-10 пассажей;диплоидный набор хромосом. 3)Перевиваемые к-ры-были пол-ны из первичных.Их можно перевив из флакона во флакон;неогран-ое кол-во пассажей.Имеет гетероплоидный набор хромосом.Некот м обладать онкогенной активностью-опухоли. 5) перевиваемые КК в суспензии. КК можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного. Лучше это удается сделать из эмбриональных органов, т.к. клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для получения их используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы. Для получения первичных клеток от здорового животного не позднее 2-3 часов после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают, обрабатывают трипсином, панкреатином, коллагеназой. Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делится. На стекле формируется слой толщиной в одну клетку, обычно через 3-5 дней. Питат среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнед клеток. Монослой сохранят жизнеспособность в течение 7-21 дня. При культив вирусов в КК удается получать препараты с высоким титром вируса, что важно при получении АГ и вакцин.

40. Индикация вирусов в КК, заражение, видимые изменения и методы контроля.Для заражения отбирают пробирки (матрасы) со сплошным клеточным монослоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Ростовую питательную среду сливают, клетки 1-2 раза промывают раствором Хенкса, чтобы удалить сывороточные АТ и ингибиторы. В каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала и покачиванием распределяют его равномерно по слою клеток. Оставляют на 1-2 часа при 22-37С для адсорбции вируса на поверхности клеток. Вируссодержащий материал удаляют из емкостей и наливают поддерживающую среду. Для индикации существуют следующие основные методы индикации вируса в КК: по цитопатическому эффекту или цитопатическому действию – это любые изменения монослоя или морфологии клеток под действием вируса (сетовая микроскопия); по положительной реакции гемадсорбции (световая микроскопия) ; по образованию бляшек; по обнаружению внутриклеточных включений; по выявлению вирусов в реакции иммунофлуоресценции; по обнаружению интерференции вирусов; по подавлению метаболизма клеток (цветная проба); электронной микроскопией. Выявление специфической дегенерации клеток (по ЦПД) – простым признаком являются дегенеративных изменения в клетках (проявление ЦПД). Наступившие видимы изменения в клетке называются цитопатические изменения. Эти изменения в инфицированных клетках зависят от дозы и биологических свойств исследуемого вируса время проявление ЦПД и его особенности иногда позволяет провести идентификацию выделенных вирусов. При инфицирования КК средними дозами вируса характер этих изменений специфичен и может быть классифицирован на группы: очаговое мелкозернистое перерождение, мелкозернистое перерождение по всему монослою, очаговое гроздевидное скопление округлых клеток, равномерная зернистость, объединение клеток в гигантские многоядерные симпласты и синцитии. Степень дегенерации оценивают по 4 бальной системе. Иногда наблюдают отсутствие ЦПД, но это считают за отсутствие вируса нельзя и потому проводят 2-3 слепых пассажа и на 2-3 пассаже вирусы могут проявлять желаемые свойства.

 

 

41. Индикация вирусов в куриных эмбрионах: заражение, признаки репродукции вируса. Основной метод индикации гемагглютинирующих вирусов.Заражение. Куриный эмбрион развивается 21 день. Заражение вирусом производится с 5-го по 12-й день. Заражение в аллантоисную полость (болезнь ньюкасла). Все операции проводят асептично с горящей газовой горелкой. Место введения обрабатывают 2% йодированным спиртом, вводят 0,1-0,2 мл жидкости. Отверстие закрывают каплей расплавленного парафина. На скорлупе пишут: название вируса, дату, фамилию. Заражение на ХАО (вирус оспы голубей). Делается отверстие в области воздушной камеры. Делается окошко «А». Отсасывается воздух из воздушной камеры. В окошко «А» капается вирус содержащая жидкость. Отверстие заклеивается лейкопластырем. На скорлупе пишется название вируса, дата, фамилия. После заражения инкубируют при 37 гр – 5 дней. Признаки репродукции вируса: Гибель куриного эмбриона в характерные для данного вируса сроки. Гибель эмбрионов в первые сутки не специфична. Эмбрионы погибшие в более поздние сроки переносятся в холодильник (+ 4С). Все эмбрионы извлекают из термостата в момент максимального накопления вируса. Срок для каждого вируса – справочные данные. Вскрытие эмбриона и анализ патологоанатомических изменений. Отечная ХАО и белые узелки некроза (оспины). Мутность или изменение цвета аллантоисной и амниотической жидкостей. Красноватый цвет жидкостей – результат гемолиза. Изменения зародыша: карликовость, кровоизлияния, мумификация. Органы зародыша – некроз, кровоизлияния. Наличие гемаглютинации при проведении капельной реакции ГА. (аллантоисная жидкость + 5% р-р эритроцитов кур). Основной метод индикации гемагглютинирующих вирусов.Гемагглютинация –этосклеивание эритроцитовпод действием вируса, который в своем составе имеет белок гемагглютенин, который взаимодействует со специфическими рецепторами эритроцитов. Каждый вирус агглютинирует эритроциты определенного вида животного: в. Бешенства- эрит. Гуся, в. Б-ни ньюкасла – эрит. Кур, парагрипп 3 – эрит. Морской свинки. По цели проведения РГА бывают: 1.)капельная – качественная. Учет реакции: зонтик – 100%эритроцитов агглютинировали (***), неполный зонтик 50% эрит аггл (**), маленький зонтик (*), пуговка (-) эритроц не агглютиноровали и осели на дно лунки. 1ГАЕ- наибольшее разведение вируса, дающее неполный зонтик. 2) количественная – определение гемагглютинирующего титра вируса. Титр вируса – это во сколько надо развести вирус, чтобы получить 1 ГАЕ. Стадии РГА:1)адсорбция вируса на поверхность эритроцитов. 2)склеивание эритроцитов за счет образования между ними мостиков из вирусов. 3)элюция (сползание) вируса с поверхности эритроцитов за счет разрушения рецепторов эритроцитов.

 

42. Индикация активного вируса: методы, живые системы, признаки положительной биопробы. Примеры.Обнаружение активной формы вируса путем биопробы (лабораторные животные, куриные эмбрионы, культура клеток). Заражение. Куриный эмбрион Признаки репродукции вируса: Гибель куриного эмбриона в характерные для данного вируса сроки. Гибель эмбрионов в первые сутки не специфична. Эмбрионы погибшие в более поздние сроки переносятся в холодильник (+ 4С). Все эмбрионы извлекают из термостата в момент максимального накопления вируса. Срок для каждого вируса – справочные данные. Вскрытие эмбриона и анализ патологоанатомических изменений. Отечная ХАО и белые узелки некроза (оспины). Мутность или изменение цвета аллантоисной и амниотической жидкостей. Красноватый цвет жидкостей – результат гемолиза. Изменения зародыша: карликовость, кровоизлияния, мумификация. Органы зародыша – некроз, кровоизлияния. Наличие гемаглютинации при проведении капельной реакции ГА. (аллантоисная жидкость + 5% р-р эритроцитов кур). Культура клеток.Для индикации существуют следующие основные методы индикации вируса в КК: по цитопатическому эффекту или цитопатическому действию – это любые изменения монослоя или морфологии клеток под действием вируса (сетовая микроскопия); по положительной реакции гемадсорбции (световая микроскопия) ; по образованию бляшек; по обнаружению внутриклеточных включений; по выявлению вирусов в реакции иммунофлуоресценции; по обнаружению интерференции вирусов; по подавлению метаболизма клеток (цветная проба); электронной микроскопией. Выявление специфической дегенерации клеток (по ЦПД) – простым признаком являются дегенеративных изменения в клетках (проявление ЦПД). Наступившие видимы изменения в клетке называются цитопатические изменения. Эти изменения в инфицированных клетках зависят от дозы и биологических свойств исследуемого вируса время проявление ЦПД и его особенности иногда позволяет провести идентификацию выделенных вирусов. При инфицирования КК средними дозами вируса характер этих изменений специфичен и может быть классифицирован на группы: очаговое мелкозернистое перерождение, мелкозернистое перерождение по всему монослою, очаговое гроздевидное скопление округлых клеток, равномерная зернистость, объединение клеток в гигантские многоядерные симпласты и синцитии. Степень дегенерации оценивают по 4 бальной системе. Иногда наблюдают отсутствие ЦПД, но это считают за отсутствие вируса нельзя и потому проводят 2-3 слепых пассажа и на 2-3 пассаже вирусы могут проявлять желаемые свойства. Лабораторные животные.Заражение лабораторных животных. 1.подкожно – спина.2.Внутрикожно – пятка. 3.Внутримышечно –бедро. 4.Внутривенно – в хвост (предварительно растерев горячей водой и пережав).5.Интранозально – капля в нос (предварительно дают слабый эфирный наркоз, что бы предупредить чихание).6.Интероцеребрально – череп аккуратно просверливается иголочкой, не нажимать, капля уходит сама. Все поверхности предварительно смазывают йодированным спиртом. Признаки индикации: 1) Клинические признаки (повышение t, изменение поведения, выделения) неспецифические. 2) гибель в определенные сроки. 3) патологоанатомическое вскрытие. От положительной биопробы отбирают вторичный патматериал дла дальнейших вирусологических исследований.

 

 

43. Экспресс-методы в вирусологии. Методы индикации вирионов вирусов. Достоинства и недостатки. Индикация вируса в патологическом материале. 1.Обнаружение – световая микроскопия крупных вирусов (Poxviridae оспа), электронная микроскопия.2.Обнаружение телец-включений. (тельца Бабе-Шенегри при бешенстве)Тельца включения – это внутриклеточные включения, образующиеся в клетке при рапродукции в них некоторых вирусов. Тельца включения чаще всего находятся в цитоплазме(чаще это РНК вирусы, кроме оспы)Оспа кур- т. Боллингера, чума плотоядных –т. Ленца, вирус Бешенства –т.Бабеша-Негри(при обнаруж их в мазках отпечатках павших животных диагноз бешенство считается доказанным).3.Обнаружение вирусных антигенов: серологические реакции. В основе лежит спос-ть Ат взаимодействовать со специфическими гомологичными Аг в прбирке(in vitro)с образованием комплекса Аг-Ат. Обычно источником Ат служит сыв-ка крови жив-го=>эти р-ции наз-ся серологическими. РИФ(реакция иммунофлюорисценции. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом). ,ИФА – иммуно-ферментный анализ. АТ-ферментным комплексом дает цветную реакцию , РНГА (реакция непрямой гемагглютинации Эритроциты нагружают АГ и при образовании комплекса АГ-АТ происходит агглютинация эритроцитов ) , РСК - реакция связывания комплемента. Задержка гемолиза – реакция положительная. Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-системой – реакция отрицательная , РДП- реакция диффузной преципитиции. Метод обнаружения – образование контура преципитации.4.Обнаружение вирусных НК (ДНК-зонды и ПЦР – полимеразно-цепная реакция) Не серолог. р-ция,напр-на на обнар-ие вир-й нукл-й к-ты(генома). Принцип:у выд-й из пат мат вир-й нукл к-ты многократно воспроизводят(копируют) опред-й наиболее консервативный уч-к «in vitro», а затем его идентифицируют .5.Обнаружение активной формы вируса путем биопробы (лабораторные животные, куриные эмбрионы, культура клеток) экспериментальное заражение материалом от больных жив. лаб. или естественно восприимчивых жив.6.Обнаружение гемаглютининов у гемаглютинирующих вирусов. Геагглютинирующ вирусы способны агглютинировать эритроциты животных определенных видов в условиях соответствующих температур и рН среды. Иногда используют реакцию гемагглютинации (РГА) для обнаружения гемагглютинирующего вируса в материале.

 

 

44. Тельца-включения: характеристика, методы индикации, роль данного метода в диагностике бешенства.Классификация. По происхождению и составу: 1)клеточные –скопление отдельных структур клеток. 2) вирусные – скопления компонентов клеток. 3) смешанные. По локализации: 1)ядерные (ДНК вирусы),2)цитоплазматические (РНК вирусы, исключение в. Оспы ДНК, но имеет цитоплазматические включения). Обычно удается рассмотреть вирионы вирусов и установить их структуру с помощью электронной микроскопии, позволяющей различать объекты размерами до 0,2-0,4 нм. Способность к окраске теми или иными красителями, размеры, форма, структура, местоположение в клетке телец-включений, образованных разными вирусами, неодинаковые, но специфичные для каждого вируса. Поэтому обнаружение в материале от больных животных внутриклеточных телец-включений с определенными характеристиками позволяет судить о том, каким вирусом они образованы, а значит, и о присутствии этого вируса в исследуемом материале. Для обнаружения телец-включений готовят мазки или отпечатки (посмертно или прижизненно), которые подвергают специальным методам окраски с последующей микроскопией. Для телец-включений, образуемых разными вирусами, методы окраски различны. Для индикации вируса бешенства – световая иммерсионная микроскопия, окраска по Селлерсу и Туревичу, обнаружение телец Бабеша-Негри. Тельца включения – это внутриклеточные включения, образующиеся в клетке при рапродукции в них некоторых вирусов. Тельца включения чаще всего находятся в цитоплазме(чаще это РНК вирусы, кроме оспы)Оспа кур- т. Боллингера, чума плотоядных –т. Ленца, вирус Бешенства –т.Бабеша-Негри(при обнаруж их в мазках отпечатках павших животных диагноз бешенство считается доказанным).

 

 

45. Титрование вирусов по инфекционной активности. ЭД50 вируса, методика титрования и статистическая обработка результатов титрования (метод Кербера).Эффективная доза (ЭД) – это такая доза вируса, которая при введении четному количеству живых систем вызывает эффект в 50% случаев. Эффективная доза зависит от вида живой системы и от эффекта, по коротому титруют вирус.

Эффект действия Лабораторн. Животные КЭ КК
Летальность ЛД50 летальная доза ЭЛД 50 ---
Клинич. Признаки ИнфД50 --- ---
Патанатомич. Изменения ИД ЭИД50 ЦПД50 цитопатич д.
Локальные изменения --- ООЕ оспа обр. един. БОЕ бляшкобредин

1)1мл вируса+9мл физ р-ра (1:10)-V –перенос 1 мл(1:10 в2ст)V-перенос 1мл (1:10 в 3 ст)V-перенос 1 мл(1:10 в 4 ст)V-перенос 1мл(1:10 в 5 ст)V- перенос 1мл(1:10 в 6 ст)V-1мл в дез р-р.2)каждым разведением вируса заражают четное равное количество живых систем в дозе 0.2 мл. Реакция гемадсорбции(РГАд) – не серологическая реакция. Некоторые вирусы имеют в своем составе белок гемагглютенин. При проникновении такого вируса сквозь клеточную оболочку, вирусные булки встраиваются в нее и она приобретает их свойства. В основе гемадсорбции лежит родство рецепторов вируса находящегося на поверхности зараженной клетки с рецепторами эритроцитов. Принцип РГАд заключается в адсорбции эритроцитов определенного вида на клетках зараженных вирусом. То разведение, где половина живых систем проявит гемадсорбцию – будет 1 ЭД50. Титр вируса равен числу во сколько раз развели вирус, чтобы получить 1 ЭД50. Количество вируса можно определить по эффективности его действия в живой системе. Типы эффективного действия вируса:1) инфекционная активность вируса (обладают все вирусы), 2) гемагглютинирующая активность. Цели определения титра вируса: 1)определение рабочей дозы вируса для серологических реакций.2) определение противовирусной активности вакцин.3)контроль активности вируса при хранении.4)постановка биопробы.5) получение гипериммунных сывороток.

 

 

46.Титрование вирусов по гемагглютинирующей активности. ГАЕ вируса, методика титрования и определение титра вируса.Не серологическая реакция. Основной метод индикации гемагглютинирующих вирусов.Гемагглютинация –этосклеивание эритроцитовпод действием вируса, который в своем составе имеет белок гемагглютенин, который взаимодействует со специфическими рецепторами эритроцитов. Каждый вирус агглютинирует эритроциты определенного вида животного: в. Бешенства- эрит. Гуся, в. Б-ни ньюкасла – эрит. Кур, парагрипп 3 – эрит. Морской свинки. По цели проведения РГА бывают: 1.)капельная – качественная. Учет реакции: зонтик – 100%эритроцитов агглютинировали (+++), неполный зонтик 50% эрит аггл (++), маленький зонтик (+), пуговка (-) эритроц не агглютиноровали и осели на дно лунки. 1ГАЕ- наибольшее разведение вируса, дающее неполный зонтик. 2) количественная – определение гемагглютинирующего титра вируса. Титр вируса – это во сколько надо развести вирус, чтобы получить 1 ГАЕ(++). Стадии РГА:1)адсорбция вируса на поверхность эритроцитов. 2)склеивание эритроцитов за счет образования между ними мостиков из вирусов. 3)элюция (сползание) вируса с поверхности эритроцитов за счет разрушения рецепторов эритроцитов. Титр – это кол-во вируса, содер в ед объема материала.Вир имеют белок- гемагглютинин.Они склеивают эр. Титр опред-ют по эф-ту гемагглютинации.Выр-ся ГАЕ(гемагл ед). Р-ция пров-ся в плестеглазовых (пласти-ковых) планшетах.Не треб-ся стирильн условий: 1)Готовят последов-ое 2х кратное развед вир(1:2,1:4,1:8…) 2)В каждое развед доб-ют равный V 1% взвеси эритр-в опред-го вида и оставл-ют на контакт 3) Учет реакции с того момента как сработал контроль: зонтик – 100%эритроцитов агглютинировали (+++), неполный зонтик 50% эрит аггл (++), маленький зонтик (+), пуговка (-) эритроц не агглютиноровали и осели на дно лунки. 4)Опред-ют гемаглют-й титр(Тга):снач узнают в каком развед нах-ся 1ГАЕ. Титр вируса – это во сколько надо развести вирус, чтобы получить 1 ГАЕ(++) Берем 6 пробирок,6-контроль(эр+физ р-р): 1)(1:2)0,2мл физ р-ра(разбавитель)+0,2мл вир БН+0,2мл 1%взвеси эр-в петуха;2)(1:4)0,2мл из пред-й проб-ки+0,2физ р-ра+0,2 1%взвеси и тд до 5-й.Оставляем на контакт на 30 мин при комн-й темпер-ре. От чего зав-т р-ия ГА:1)от наличия вир гемагглютинирующего 2)исп-ся эр опред-го вида хозяина(ВБН-эр кур и петухов); 3)опред усл для постан р-ции:буф-й р-р (физ р-р,карбонатный,фосфатный буфер); рН(нейтр),комн темп,вр



©2015- 2017 stydopedia.ru Все материалы защищены законодательством РФ.